基于加權基因共表達網絡分析篩選結腸癌關鍵長鏈非編碼RNA及其競爭性內源RNA網絡構建△

李倩，盧金磊，王會新，崔馨桐，王建喬，侯曉雯，馮旭

沈陽醫學院公共衛生學院，沈陽 110034

結腸癌是西歐、北美等發達國家最常見的惡性腫瘤，也是中國最常見的惡性腫瘤之一[1]。由于缺乏早期癥狀，且臨床常用的腫瘤標志物缺乏對早期結腸癌的診斷效能，大部分患者確診時已處于中晚期，預后較差[2]。近些年研究發現，長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）在腫瘤的發生、發展、預后及轉歸中發揮著重要作用，與結腸癌發生發展相關的lncRNA報道也逐漸增多[3]。加權基因共表達網絡分析（weighted gene co-expression network analysis，WGCNA）被廣泛用于生物基因研究中，通過聚類的方式更加快捷地找到關鍵基因，同時發現關鍵基因可能的功能，極大提高了研究速度及準確性[4-6]。本研究通過來自癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）數據庫和GEO數據庫的數據，構建結腸癌lncRNA的共表達網絡，篩選得到的lncRNA能夠為進一步研究結腸癌的潛在發病機制提供參考，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 數據下載及處理

從GEO數據庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）下載GSE126092芯片中的數據，包括10對結腸癌組織及癌旁組織。從TCGA數據庫（https//portal.gdc.cancer.gov/）下載結腸癌轉錄組數據，其中包括結腸癌組織482例和正常結腸組織42例。分析工具主要為R軟件（R×64 4.02版本）及各類R包、Cytoscape（3.8.0版本）以及各類在線數據分析網站。

1.2 結腸癌相關lncRNA的篩選

通過R軟件中的limma程序包，對GEO數據進行背景校正、標準化處理以及差異表達分析，篩選標準為：|logFC|≥1.5，校正后P＜0.05。差異分析的結果用R軟件中pheatmap程序包繪制的火山圖進行可視化分析。

對TCGA數據庫下載的結腸癌組織和正常結腸組織表達譜數據進行WGCNA分析，首先進行離群值的篩選，隨后進行軟閾值的確定，使用R軟件自帶的層次聚類函數hclust進行聚類分析，使用不同的顏色標記聚類分析中的模塊。模塊與樣本信息進行相關性分析，從中選擇與結腸癌相關性最高的模塊，獲取該模塊基因進行后續分析。

對GEO數據中的差異表達lncRNA和WGCNA性狀相關模塊中的lncRNA取交集，獲取關鍵lncRNA，進行后續分析。

1.3 競爭性內源RNA（competing endogenous RNA，ceRNA）調控網絡的構建

對上述獲得的lncRNA進行ceRNA網絡的構建，使用Starbase（http://starbase.sysu.edu.cn/）預測lncRNA的靶向miRNA，使用miRDB數據庫（http://mirdb.org/）和Targetscan數據庫（http://www.targetscan.org/）預測miRNA的靶基因mRNA。基于上述篩選出的lncRNA、miRNA、mRNA，采用Cytoscape（3.8.0版本）構建并繪制ceRNA調控網絡。

1.4 構建蛋白質-蛋白質相互作用（protein-protein interaction，PPI）網絡

使用String數據庫構建PPI網絡。輸入基因集為 mRNA；種屬選擇為 Homo sapiens；combined score≥0.7。使用Cytoscape（3.8.0版本）軟件可視化PPI數據。

1.5 基因功能分析

使用DAVID在線數據庫（https://david.ncifcrf.gov/）進行mRNA的基因本位（Gene Ontology，GO）功能分析和京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析。

2 結果

2.1 結腸癌相關lncRNA的篩選

2.1.1 GEO 中差異表達lncRNA的篩選GEO數據庫GSE126092芯片中共篩選出322個差異表達的lncRNA，包含113個上調基因和209個下調基因。（圖1）

圖1 GEO數據庫GSE126092芯片中差異表達的lncRNA火山圖

2.1.2 WGCNA 分析結果 經樣本聚類分析后刪除15個離群樣本。為使得鄰接函數滿足無尺度網絡的條件，選取β=3進行后續分析，此時共表達網絡接近為無尺度網絡。根據β=3進行切割設置得到基因聚類樹，每個模塊最少基因數目設置為30，得到7個lncRNA模塊（圖2A）。對模塊與樣本特征進行相關性分析，最終確定綠色模塊（cor=0.85，P＜0.05）為與結腸癌相關性最高的模塊（圖2B）。對GEO中差異表達的lncRNA和綠色模塊中的lncRNA取交集，最終獲得6個結腸癌的關鍵lncRNA，分別為鋅指NFX1結構1反義RNA1（zinc finger NFX1-type containing 1 antisense RNA 1，ZFAS1），β1,3-半乳糖基轉移酶5反義RNA1（beta-1,3-galactosyltransferase5antisenseRNA 1，B3GALT5-AS1），細胞色素P450家族1亞家族B成員1反義RNA1（cytochrome P450 family 1 subfamily B member 1 antisense RNA 1，CYP1B1-AS1），二肽基肽酶樣10反義RNA1（dipeptidyl peptidase like 10 antisense RNA 1，DPP10-AS1），VPS9包含域1反義RNA1（VPS9 domain containing 1 antisense RNA 1，VPS9D1-AS1）和細胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子2B反義RNA1（cyclin dependent kinase inhibitor 2B antisense RNA 1，CDKN2B-AS1）。

圖2 WGCNA 分析結果

2.2 構建ceRNA調控網絡

預測出與6個關鍵lncRNA可能相互作用的24個miRNA，以及24個miRNA可能的靶基因mRNA共346個，構建了lncRNA介導的ceRNA網絡圖。（圖3）

圖3 構建結腸癌的lncRNA-miRNA-mRNAceRNA網絡圖

2.3 PPI網絡構建

構建PPI網絡圖鑒定ceRNA網絡中mRNA蛋白質間的相互作用關系，發現一些聯合評分比較高的mRNA，分別為：雌激素受體1（estrogen receptor 1，ESR1）、小窩蛋白1（caveolin1，CAV1）、間質-上皮細胞轉化因子（mesenchymal-epithelial transition factor，MET）、鈣黏蛋白相關蛋白β1（cadherinassociated protein beta 1，CTNNB1）、磷脂酰肌醇轉移蛋白 3（phosphatidylinositol transfer protein 3，PITPNM3）和趨化因子 18（chemokine ligand 18，CCL18）。（圖4）

圖4 PPI網絡圖

2.4 基因功能分析

對346個mRNA進行GO功能分析和KEGG富集分析。GO功能分析結果顯示，生物功能主要集中在DNA模板轉錄調控、RNA聚合酶Ⅱ基因啟動子的轉錄調控和RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉錄負向調控等；細胞功能主要集中在細胞核、突觸、神經細胞體、突觸后密集區和微管相關復合體；分子功能主要集中在核酸結合、金屬離子結合、DNA結合等。KEGG富集分析結果顯示，基因主要富集在癌癥蛋白聚糖、磷脂酰肌醇-3-羥激酶（phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase，PI3K）-蛋白激酶 B（protein kinase B，PKB，又稱AKT）信號通路、Rap1信號通路和局部粘連等。（圖5、圖6）

圖5 GO功能分析

圖6 KEGG富集分析

3 討論

結腸癌發生與社會環境、高脂肪飲食、遺傳等密切相關，具有發病率高、轉移率高、治愈率低等特點[7]。因此，非常有必要在分子水平上開發新的生物標志物和潛在靶點以預防和治療結腸癌。WGCNA可以通過系統繪制個體生物網絡互作圖精準找出與研究相關的核心基因，極大提高了研究速度及準確性[4,8]。因此，本研究通過構建結腸癌WGCNA共表達網絡，尋找與結腸癌具有密切關聯性的lncRNA。

本研究從GEO數據庫中共篩選出322個差異基因，從TCGA數據庫中共獲得1688個lncRNA的表達矩陣，進行WGCNA構建后，綠色模塊為與結腸癌相關性最高的模塊，對GEO數據中差異表達的lncRNA和TCGA綠色模塊中的lncRNA取交集后最終獲得6個結腸癌的關鍵lncRNA。構建的ceRNA網絡提示其在結腸癌中的可能作用機制，但仍需進一步實驗驗證。

已有研究表明這6種lncRNA在腫瘤的發生發展中發揮重要作用。ZFAS1定位于人類染色體20q13，研究發現ZFAS1與結腸癌的分化程度、T分期及N分期有關，高表達ZFAS1是結腸癌預后不良的危險因素[9-10]。馮偉[11]發現，胃癌患者血清B3GALT5-AS1表達上調，可能作為潛在的胃癌輔助診斷及預后監測的生物標志物。另有研究發現，DPP10-AS1、VPS9D1-AS1和CDKN2B-AS1均具有促進肺癌細胞增殖的作用，可促進肺癌惡性進展[12-14]。雖然現有研究表明B3GALT5-AS1、CYP1B1-AS1、DPP10-AS1、VPS9D1-AS1和 CDKN2B-AS1與腫瘤的發生發展有關，但并未有研究表明它們與結腸癌相關，因此如將其作為一種診斷指標，仍需進一步研究以提供更可靠的依據。

綜上所述，本研究利用GEO數據庫和TCGA數據庫以及WGCNA方法篩選出與結腸癌可能相關的6個lncRNA，分別為ZFAS1、B3GALT5-AS1、CYP1B1-AS1、DPP10-AS1、VPS9D1-AS1和 CDKN2B-AS1，并且構建了相關的ceRNA調控網絡，為進一步探索結腸癌的機制研究提供了依據。