白花香蓮解毒顆粒治療HBeAg 陽性慢性乙型肝炎的臨床療效及對血漿外泌體miR-122表達的影響?

蒙蔭杰，邱 華，黃 鵬，李 旺，毛德文

1 廣西中醫藥大學，廣西 南寧 530001； 2 廣西中醫藥大學第一附屬醫院，廣西 南寧 530023

慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）是乙肝病毒（hepatitis B virus，HBV）感染肝臟后引起的一種慢性傳染性疾病。由CHB 導致的相關疾病，如肝硬化、肝癌等，其治療費用給家庭和社會帶來了沉重的負擔。miR-122 是肝臟中特異性表達量最多的miRNA，占成年人肝臟中總MicroRNAs（miRNAs）的70%［1］。研究表明，miR-122過表達能夠抑制HBV的復制［2］。本課題組前期研究發現，壯藥白花香蓮解毒顆粒能夠抑制HBV-DNA的復制及HBeAg分泌，同時可改善肝功能［3］。為了進一步明確其臨床療效及作用機制，筆者使用隨機對照研究方法，觀察治療前后兩組臨床療效、乙肝兩對半定量、血漿外泌體miR-122、乙肝病毒脫氧核糖核酸（HBV DNA）的水平、肝功能并記錄不良反應事件，現將結果報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料選取2018年6月至2019年10月在廣西中醫藥大學第一附屬醫院肝病科門診就診的120例HBeAg陽性的慢性乙型肝炎患者，隨機分為對照組和觀察組，每組60例，同時納入30例健康體檢者作為健康組。觀察組中男38例，女22例；平均年齡（37.25±5.81）歲；平均病程（14.18±5.83）年；血清HBV DNA（6.57±0.96）copies/mL；HBeAg滴度為（942.31±527.18）S/Co；血清丙氨酸氨基轉移 酶（alanine aminotransferase，ALT）為（107.52±23.46）U/L。對照組中男43例，女17例；平均年齡（38.14±6.32）歲；平均病程（13.52±6.47）年；血清HBV DNA（6.43±0.87）copies/mL，HBeAg 滴 度 為（926.45±516.73）S/Co；ALT 為（102.83±25.31）U/L。兩組基線資料比較，差異均無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 診斷標準納入：1）符合文獻［4］中HBeAg陽性慢性乙型肝炎的診斷標準者；2）血清HBeAg、HBsAg均為陽性者；3）年齡18～65歲者；4）本研究經醫院倫理委員會批準（倫理編號：AF/SC-08/03.1），且患者簽署知情同意書者。

1.3 排除標準排除：1）合并失代償期肝硬化、肝細胞癌、肝性腦病及其他嚴重的全身性疾病和精神病者；2）HIV 抗體陽性者；3）合并其他類型肝炎病毒者；4）對恩替卡韋耐藥者；5）孕婦及哺乳期婦女；6）近3月內曾參加其他臨床試驗者。

1.4 治療方法對照組給予恩替卡韋（正大天晴藥業集團股份有限公司，國藥準字H20100019，批號：18015461）口服，每日0.5 mg，每日1次。共治療48 周。觀察組抗病毒治療與對照組相同，同時服用白花香蓮解毒顆粒（藥物組成：白花蛇舌草30 g，三葉香茶菜20 g，黃花倒水蓮15 g，排錢草15 g），每日2 次，每次2 袋，早晚飯后溫服。兩組均治療48周。

1.5 觀察指標于治療前及治療12、24、48 周時測定以下指標。

1.5.1 乙肝兩對半定量 采用雅培公司的化學發光免疫法檢測試劑盒檢測乙肝兩對半定量。

1.5.2 外泌體miR-122 的測定 采集各組試驗者外周靜脈血5 mL，標本以3000×g離心10 min，吸取血漿。按照外泌體試劑盒說明書（大連美侖生物技術有限公司）提取外泌體，采用western blot 檢測外泌體表面標志性marker CD63、CD9 來對外泌體進行鑒定。提取外泌體后，嚴格按照Trizol 試劑盒（購自上海名勁生物科技有限公司）說明書操作，采用Trizol 法提取總RNA，并在260、280 nm 波長下檢測RNA 溶液的吸光度，若A260/A280為1.8～2.1，可進行下一步實驗。配制逆轉錄反應體系，合成cDNA。PCR 擴增：實驗標本均擴增miR-122 及U6 兩個基因，以CT 值形式表示RT-PCR檢測結果，采用U6作為內參，miR-122的相對表達量以2-ΔCt表示。

1.5.3 HBV DNA 定量 采用熒光定量PCR 法檢測血清HBV DNA 載量（試劑盒購自廣東凱普生物科技股份有限公司）。

1.5.4 肝功能檢測 采用日本奧林巴斯公司的全自動生化儀進行肝功能檢測：ALT、天冬氨酸氨基轉移酶（aspartate aminotransferase，AST）、血清總膽紅素（total bilirubin，TBiL）、白蛋白（albumin，ALB）水平。因ALT 水平與肝臟病理學顯著的炎癥壞死和纖維化相關，因此本研究主要觀察ALT水平作為肝功能恢復的指標。

1.5.5 安全性指標 觀察兩組血常規、腎功能、心電圖，并記錄不良反應事件。

1.5.6 臨床療效［4］顯效：ALT、TBiL值恢復正常，HBeAg 血清學轉換，HBV-DNA（-）。有效：ALT、TBiL值恢復正常或下降50%以上，HBeAg（-）或HBV-DNA（-），或HBeAb（+）。無效：未達到上述指標者。

1.7 統計學方法應用SPSS 20.0 統計軟件進行數據處理，計量資料以±s 表示，采用t檢驗；計數資料以n（%）表示，采用χ2檢驗。P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HBeAg 水平比較治療12、24、48 周時，觀察組HBeAg滴度顯著低于對照組（P＜0.05）。見表1。

表1 兩組HBeAg水平、miR-122相對表達量、HBV-DNA及ALT水平比較（±s）

注：與本組治療前比較，a表示P＜0.05，b表示P＞0.05；與對照組同期比較，c表示P＜0.05，d表示P＞0.05，-表示無數值

組別例數ALT（U/L）107.52±23.46d觀察組60 61.72±18.54a，c 41.48±7.52a，c 12.46±3.61a，c 102.83±25.31對照組60 69.47±21.49a 47.85±9.26a健康組18.35±4.68a-30時間治療前治療12周治療24周治療48周治療前治療12周治療24周治療48周-HBeAg（S/Co）942.31±527.18d 723.56±228.71a，c 402.13±204.25a，c 184.37±103.54a，c 926.45±516.73 874.43±352.62a 751.26±243.46a 331.28±215.41a-miR-122水平0.51±0.26c，d 2.82±0.74a，c 6.57±1.26a，c 10.62±2.17a，c 0.48±0.24 0.50±0.22b 0.53±0.25b 0.56±0.21b 1.21±0.37 HBV-DNA（copies/mL）6.57±0.96d 4.31±0.24a，c 3.14±0.42a，c 0.84±0.12a，d 6.43±0.87 4.75±0.81a 3.81±0.56a 0.87±0.15a-

2.2 血漿miR-122 相對表達量治療前，兩組血漿中miR-122 的相對表達量比較，差異無統計學意義（P＞0.05），兩組與健康組比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）；治療后，在12、24、48 周時，觀察組高于治療前，且同時段比較，觀察組均高于對照組（P＜0.05）；對照組治療12、24、48周時與治療前比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

2.3 血清HBV-DNA 定量及ALT 水平治療前，兩組血清HBV-DNA、ALT水平比較，差異均無統計意義（P＞0.05）；治療12、24、48周時，上述指標兩組較治療前均有改善（P＜0.05）。兩組同時段比較，治療12、24 周時，觀察組HBV-DNA、ALT 水平均低于對照組（P＜0.05）；治療48周進，兩組HBV-DNA比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；兩組ALT 水平比較（P＜0.05），差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

2.4 不良反應治療后，兩組受試者的血常規、腎功能及心電圖均未見明顯變化，兩組均未發生嚴重不良事件。

2.5 臨床療效治療48 周時，觀察組顯效15 例（25.00%），有 效39 例（65.00%），無 效6 例（10.00%），總有效率為90.00%（54/60）；對照組顯效7 例（11.67%），有效36 例（60.00%），無效17 例（28.33%），總有效率為71.67%（43/60）。觀察組總有效率高于對照組（P＜0.05）。

3 討論

中醫藥是我國寶貴的醫療資源，在抗病毒、調節免疫、保肝抗炎等方面具有一定的療效［5-6］。壯醫藥因其獨特的理論及治則治法為廣大人民群眾所接受。壯醫學認為，毒和虛是引起疾病的重要病因病機［7］，壯醫將HBV 病毒歸為疫毒，屬于“毒邪”范疇，當毒邪感染人體后，留于肝臟，邪正相爭，導致龍路、火路擁塞，水道、谷道、氣道不通利，毒邪內留日久，耗傷正氣，出現五臟六腑功能失調，氣血化生不足，而濁毒稽留體內，形成毒虛共存這一病機特點。因此，針對慢性乙型肝炎的病機特點，結合壯鄉地處亞熱帶的氣候環境，在“解毒補虛”這一壯醫藥理論指導下，形成了獨具特色的方藥——白花香蓮解毒顆粒。方中白花蛇舌草為主藥，解熱毒，除濕毒，通龍路；黃花倒水蓮為公藥，補虛健脾；三葉香茶菜為母藥，清解熱毒，輔助主藥增強清利濕熱、祛邪排毒之功；排錢草作為幫藥及引藥，具有清熱通利水道。諸藥相合，具有攻毒補虛，疏通三道，調暢兩路，調和陰陽之效。

外泌體（exosome）是體內細胞在多泡小體（MVBs）與細胞質膜融合時釋放的胞外囊泡，內含多種蛋白質、mRNA 和miRNA，能夠保護miRNA 免受核酸酶的降解［8］，因此外泌體內的miRNA能反映其來源細胞的功能、狀態，具有作為生物標志物的價值。miR-122 是肝臟中一種特異的miRNA，約占成年人肝臟中總miRNAs的70%，對于維持肝臟的穩態至關重要［1］。相關研究顯示，在人體感染HBV后，肝臟中miR-122的表達水平顯著下調，且miR-122的水平與肝內HBV-DNA 載量和肝壞死性炎癥呈負相關［9］。進一步研究證實［10］，HBV mRNA 含有一個與miR-122互補的結合位點，兩者結合后導致miR-122失活，因此，HBV感染者肝臟的miR-122呈低表達水平。

本研究結果顯示，治療12、24、48 周時，觀察組血漿中miR-122 相對表達量均高于治療前。治療12、24、48 周時，兩組血清中HBV-DNA 水平逐漸下降；觀察組在治療12、24周時HBV-DNA水平低于對照組；治療48周時，兩組HBV-DNA水平相當。可以看出，miR-122 的表達水平增高可以抑制HBVDNA 的復制，即miR-122 的水平與HBV-DNA 載量呈負相關。另外，治療12、24、48周時，觀察組HBeAg滴度顯著低于對照組，說明白花香蓮解毒顆粒能夠有效地抑制HBeAg 的分泌，同時我們發現miR-122與HBeAg的表達可能呈負相關，這與朱蕾等［11］的研究結果一致。

綜上所述，miR-122 的表達水平影響著HBV 的復制過程，預示著可以通過提高其表達水平來抑制HBV 的復制。壯藥白花香蓮解毒顆粒能明顯提高miR-122 的表達水平，能夠有效地抑制HBV-DNA的復制及HBeAg 的分泌，同時改善肝功能，因此，我們推測，其療效機制可能與調節血漿外泌體miR-122的表達有關。