基于TMT蛋白組學的硝酸鈾酰誘導CHO-K1細胞損傷研究

尹晶晶，劉 歡，高 潔，王志鵬，袁 慧，李建華，李建國

(中國輻射防護研究院 放射醫學與環境醫學研究所 藥物毒理與放射損傷藥物山西省重點實驗室 中核集團放射毒理與放射性藥物臨床前評價重點實驗室，山西 太原 030006)

0 引言

鈾在自然界天然存在[1],鈾溶液中主要以鈾酰離子為主要形式[2].鈾具有放射和化學雙重毒性,人們對鈾毒性的關注主要是作為重金屬元素的鈾的化學毒性而非放射毒性[3,4].鈾可通過吸入、皮膚破損、水和食物鏈等方式進入人體,對人體組織和器官造成損傷[5].研究發現,鈾進入體內可在腎臟[6]、骨骼[7]、肝臟、生殖系統[8]等多個器官富集,造成器官損傷,增加癌癥的發病率[9].文獻中報道的鈾的毒性作用機制研究主要集中在氧化應激、DNA損傷、蛋白結合與功能異常、炎癥及凋亡和自噬等[10-14],但鈾的毒性作用機制仍不清楚.

蛋白表達水平與生物學功能表型特征最相關,隨著色譜和質譜技術的飛速發展,蛋白組學研究得到飛速發展,通過檢測蛋白的表達水平,建立蛋白相互作用網絡,實現了在蛋白水平對作用機制的深入研究.應用蛋白組學在細胞層面進行鈾毒性研究較少.

因此,本研究應用串聯質譜標簽(Tandem Mass Tag,TMT)標記蛋白組學技術篩選硝酸鈾酰染毒后CHO-K1細胞中差異表達的蛋白,并對差異表達的蛋白進行功能富集分析,篩選出關鍵靶蛋白和信號通路,以期進一步探索硝酸鈾酰染毒對CHO-K1細胞損傷潛在的分子機制.

1 材料與方法

1.1 實驗材料與儀器

1.1.1 主要材料

CHO-K1細胞,購于中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫.

硝酸鈾酰(美國Sigma公司)；F-12K培養基(美國Gibco公司)；胎牛血清(美國Gibco公司)；SDS裂解液(上海碧云天公司)；BCA蛋白定量試劑盒(美國ThermoScientific公司)；PMSF(美國Amresco公司)；TMT標記試劑盒(美國ThermoFisher公司)；質譜級乙腈(美國ThermoScientific公司)；羥胺(美國Sigma公司)；質譜級水(美國ThermoScientific公司).

1.1.2 主要儀器

CO2培養箱(美國ThermoScientific公司)；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)電泳儀(北京市六一儀器廠)；酶標儀(上海科華實驗系統有限公司)；全自動數碼凝膠圖像分析系統(上海天能科技有限公司)；Q Exactive plus質譜儀(美國ThermoFisher公司)；高pH分離液相色譜儀(美國Agilent公司).

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養

CHO-K1細胞培養于含10% 胎牛血清的F-12K培養基中,置于37 ℃,5% CO2培養箱中培養.

1.2.2 細胞存活率測定

采用Cell Counting Kit-8(CCK-8)法測定細胞存活率.分別加入0 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L、300 μmol/L和500 μmol/L 硝酸鈾酰,在37 ℃,5% CO2培養箱孵育12 h、24 h、48 h和72 h后,去除培養基,每孔加入100 μl空白培養基和10 μl CCK-8溶液，于37 ℃孵育2.5 h,使用酶標儀檢測450 nm波長處的OD值,實驗重復3次.細胞存活率=(染毒孔-空白孔)/(對照孔-空白孔)× 100%.

1.2.3 TMT標記及蛋白組學檢測

實驗分為對照組和硝酸鈾酰染毒組.對照組細胞為正常CHO-K1細胞,硝酸鈾酰染毒組染毒濃度為500 μmol/L,染毒時間24 h.加入裂解液和蛋白酶抑制劑PMSF,取對照組和染毒組CHO-K1細胞提取總蛋白.

提取出的總蛋白用胰蛋白酶酶解后,加入TEAB緩沖液,用TMT試劑盒進行肽段標記,加入TMT試劑,渦旋混勻后室溫放置1 h,加入5%羥胺反應15 min,-80 ℃保存備用.

反相色譜分離,色譜條件:流動相ACN-H2O,流速300 μL/min.收集樣品后真空冷凍干燥抽干,進行色譜-質譜聯用分析.

1.2.4 數據處理

應用Proteome DiscovererTM 2.4(美國ThermoFisher公司)軟件進行數據分析,使用的數據庫為Uniprot,檢索條件為FDR < 0.01.以差異倍數FC > 1.5,且差異顯著性P-value < 0.05為標準篩選差異表達蛋白.

1.2.5 生物信息學分析

對篩選出的差異表達蛋白進行基因本體(Gene Ontology,GO)功能注釋分析、京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)信號通路分析及蛋白相互作用網絡分析.

2 結果與討論

2.1 細胞存活率測定結果

CHO-K1細胞經0 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L、300 μmol/L、500 μmol/L 硝酸鈾酰染毒12 h、24 h、48 h和72 h,細胞存活率測定結果如圖1所示.由圖1可知，隨著硝酸鈾酰濃度的升高,細胞存活率逐漸降低,且隨著作用時間的增加,細胞存活率也呈下降趨勢.染毒12 h后50 μmol/L染毒組細胞存活率較對照組顯著降低(P<0.05),100 μmol/L、300 μmol/L和500 μmol/L染毒組細胞存活率顯著降低(P<0.01)；染毒24 h后50 μmol/L、100 μmol/L、300 μmol/L和500 μmol/L染毒組細胞存活率顯著降低(P<0.01)；染毒48 h后50 μmol/L、100 μmol/L、300 μmol/L和500 μmol/L染毒組細胞存活率顯著降低(P<0.01)；染毒72 h后50 μmol/L和300 μmol/L染毒組細胞存活率顯著降低(P<0.05),100 μmol/L和500 μmol/L染毒組細胞存活率顯著降低(P<0.01).

圖1 不同濃度硝酸鈾酰染毒不同時間CHO-K1細胞存活率

2.2 蛋白鑒定結果

CHO-K1細胞經500 μmol/L硝酸鈾酰染毒24 h,提取蛋白質,經胰蛋白酶消化和TMT標記,利用液質聯用技術進行分析,分析后進行數據庫檢索,共獲得蛋白譜圖42 401張,肽段數量23 553條,鑒定出蛋白4 772個.

2.3 硝酸鈾酰染毒誘導的CHO-K1細胞差異蛋白篩選結果

以差異倍數大于1.5倍,P<0.05為差異顯著性標準,如圖2所示,染毒組與對照組相比篩選出差異表達蛋白309個,其中164個蛋白上調表達,145個蛋白下調表達.

圖2 染毒組CHO-K1細胞差異表達蛋白數量

以log2(差異倍數)為橫坐標,-log10(P-value)為縱坐標,繪制差異表達蛋白火山圖,如圖3所示,紅色的點為上調差異表達蛋白,藍色的點表示下調差異表達蛋白,灰色的點為非顯著差異表達蛋白,距離0點越遠表示差異越大,可以顯示染毒組與對照組蛋白的具體差異.

圖3 差異表達蛋白火山圖

2.4 差異蛋白表達水平聚類分析

如圖4所示,以熱圖形式顯示差異表達蛋白的聚類分析,紅色表示高表達蛋白,藍色表示低表達蛋白,每行表示每個蛋白在不同組中的表達量情況,每列表示每個組中所有差異蛋白的表達量情況.同組蛋白特征相似的聚在一起,不同組蛋白相似率越低,樣本間距離越遠,表明對照組和染毒組樣本具有明顯差異.

圖4 差異蛋白表達水平聚類分析圖

2.5 差異表達蛋白GO富集分析結果

通過GO富集分析對篩選出的309個差異表達蛋白進行生物過程(Biological Process)、細胞成分(Cellular Component)和分子功能(Molecular Function)三方面的分析,研究差異表達蛋白在功能上的分布.通過GO分析結果顯示309個差異表達蛋白富集于1 086種生物過程,282種細胞成分和377類分子功能.圖5顯示了生物過程、細胞成分和分子功能三類富集分析差異顯著性前十的條目.

圖5 染毒組差異蛋白GO富集分析結果

生物過程分析如表1所示.差異表達蛋白主要涉及翻譯、核糖體小亞基生物發生、rRNA加工、β-淀粉樣蛋白的形成、鋅離子跨膜輸入、透明質酸代謝過程、受體活性的正向調節、維生素D受體信號通路的調節、肌肉結構發展及核糖體小亞基組裝.

表1 差異表達蛋白的主要生物過程分析

細胞成分分析如表2所示.差異表達蛋白主要涉及細胞質小核糖體亞基、細胞核、染色體、小核糖體亞基、外泌體、核小體、血紅蛋白復合體、小亞基加工體、U2型剪接前體及顆粒組分.

表2 差異表達蛋白的主要細胞成分分析

分子功能分析如表3所示.差異表達蛋白主要涉及poly(A)RNA結合、核糖體的結構成分、線粒體靶向序列結合、氧運輸活性、甘露糖結合、維生素D受體結合、維甲酸受體結合、氧氣結合、鋅離子跨膜轉運體活性及酶激活活性.

表3 差異表達蛋白的主要分子功能分析

2.6 差異表達蛋白KEGG富集分析結果

KEGG通路分析結果顯示,本研究篩選出的309個差異表達蛋白涉及197條信號轉導通路,其中差異顯著(P<0.05)的通路有40條.差異顯著性排前20的通路如圖6所示,主要包括核糖體生物合成、核糖體、真核生物中的核糖體生物合成、瘧疾、剪接體、分泌系統、RNA運輸、輔因子代謝、Notch信號通路、吞噬體、染色體及相關蛋白、蛋白質外排、全身性紅斑狼瘡、生理節律、IL-17信號通路、類脂物代謝.氣泡越大的通路包含的差異蛋白數目越多,氣泡顏色與富集程度有關,P值越小,顯著程度越大.

圖6 染毒組差異蛋白KEGG富集Top20氣泡圖

差異表達蛋白在KEGG通路中的分布如圖7所示.主要分布在這幾類信號通路中：蛋白家族：遺傳信息處理；蛋白家族：信號傳導和細胞過程;翻譯；蛋白家族：代謝;信號轉導.

圖7 染毒組差異蛋白KEGG分布

2.7 差異表達蛋白相互作用分析

使用STRING數據庫對差異表達蛋白進行分析,獲得差異表達蛋白的互作關系如圖8所示.關聯度最高的是G3HKG8和G3ICY6，G3HKG8是核糖體蛋白質S3A(ribosomal protein S3A,RPS3A),G3ICY6是核糖體蛋白質S17(ribosomal protein S17,RPS17).RPS3A和RPS17屬于核糖體蛋白家族,RPS3A位于40S核糖體亞基的外層,是核糖體與18S rRNA、mRNA、起始因子eIF-2和eIF-3、延伸因子EF-1和EF-2連接的位置,因此RPS3A在核糖體翻譯功能啟動中起關鍵作用[15].研究發現RPS3A表達水平的變化,影響了核糖體翻譯功能的啟動,影響了蛋白質的合成,蛋白質合成作為生命活動中的重要過程,其合成受到抑制將導致細胞發生凋亡[16].RPS17蛋白也位于40S核糖體亞基,作用于翻譯起始密碼子,影響蛋白的生物合成[17].目前研究報道的鈾的毒性作用機制主要有氧化脅迫、DNA損傷、蛋白結合和功能異常、炎癥激活及凋亡和自噬[18].研究結果表明硝酸鈾酰暴露可能誘導CHO-K1細胞發生凋亡和蛋白功能異常.

圖8 差異蛋白相互作用網絡分析結果

3 結論

近年來TMT體外標記技術廣泛用于差異表達蛋白質分析研究,具有通量高、重復性好且定量準確、分辨率高、數據豐富和自動化程度高的優點.本研究采用TMT標記蛋白技術對硝酸鈾酰暴露的CHO-K1細胞蛋白進行鑒定,共鑒定獲得肽段數量23 553條,鑒定出蛋白4 772個.

本研究應用TMT標記蛋白組學技術對硝酸鈾酰暴露致CHO-K1細胞損傷的蛋白進行篩選,篩選出差異表達1.5倍以上的蛋白309個,其中164個表達上調,145個表達下調.

GO分析表明差異表達的蛋白主要參與1 086種生物過程,282種細胞成分以及377類分子功能,生物過程中翻譯、β-淀粉樣蛋白的形成、鋅離子跨膜輸入、透明質酸代謝過程、受體活性的正向調節、肌肉結構發展和核糖體小亞基組裝表達上調,核糖體小亞基生物發生、rRNA加工和維生素D受體信號通路的調節表達下調；細胞成分中細胞質小核糖體亞基、細胞核、染色體、小核糖體亞基、外泌體、核小體、顆粒組分和血紅蛋白復合體表達上調,小亞基加工體和U2型剪接前體表達下調；分子功能中poly(A)RNA結合、核糖體的結構成分、線粒體靶向序列結合、氧運輸活性、甘露糖結合、維甲酸受體結合、氧氣結合、鋅離子跨膜轉運體活性和酶激活活性表達上調,維生素D受體結合表達下調.

KEGG通路分析表明差異蛋白富集于40條信號轉導通路.主要參與核糖體生物合成、RNA運輸、輔因子代謝、Notch信號通路、吞噬體、染色體及相關蛋白、蛋白質外排、生理節律、IL-17信號通路、類脂物代謝等信號通路.GO功能富集分析和KEGG信號通路分析結果為進一步探索硝酸鈾酰染毒對CHO-K1細胞損傷的影響及潛在的分子機制提供數據.

對差異表達蛋白進行互作網絡分析,關聯度最高的是RPS3A和RPS17.下一步RPS3A和RPS17可作為硝酸鈾酰暴露致CHO-K1細胞損傷的潛在生物標志物進行研究.