黃金梅，鐘海藝，楊舒悅，黃鳳玲

(廣西中醫藥大學 藥學院，廣西 南寧 530200)

0 引言

分子印跡技術(Molecular Imprinting Technique，MIT)是將具有一定功能基的功能單體與特定的模板分子結合成單體-模板分子復合物，在交聯劑、引發劑的條件下引發聚合反應；再通過物理或者化學法除去模板分子，高分子聚合物主體上就留下了在大小、形狀以及功能排列上與模板分子相互匹配的空穴，該空穴對目標分子有專一識別功能[1,2].近年來，由于MIT本身所具有高度分離選擇性而被應用于手性藥物的拆分、吸附分離、酶催化等方面[3-7].目前，MIT已經成為了世界上的很多國家、學術機構、企事業單位的研究熱點[8].

葛根[9]是中藥豆科植物野葛Pueraria lobate(Willd.)Ohwi.或者甘葛藤(也稱粉葛)Pueraria thomsonii Benth的根.有生津止渴、通絡活經、解肌退熱、升陽止瀉、解酒之功效[10-12].葛根素是中藥葛根中的主要成分，為異黃酮類化合物，水溶性弱，能溶于多種有機溶劑中[13].現代藥理研究表明，葛根素具有降低血壓、抗癌、抗炎等藥理作用[14].臨床上主要用于治療心律失常、高血壓、心絞痛等疾病，并取得了一定的療效[15].目前，對于葛根素的提取分離多采用傳統技術，例如溶劑提取法、加熱回流法、大孔樹脂吸附法等，雖能達到一定的提取分離效果，但存在效率低下、溶劑耗費大、有效成分提取不完全等不足.

因此，本文采用分子印跡技術制備以葛根素為模板分子的葛根素溫敏分子印跡聚合物，過程中引入溫敏單體N-異丙基丙烯酰胺，因其分子鏈上同時具有一個親水性的酰胺基和一個親酯性的異丙基，使葛根素MIPs具有低溫溶脹高溫收縮的特點，通過改變外界環境溫度即可控制模板分子的結合與釋放[16-18].本文旨在以葛根素MIPs為材料，探討其從中藥復雜成分中分離富集出目標化合物葛根素的可行性，該研究對MIT在中藥領域的發展具有重要意義.

1 材料與方法

1.1 主要原料

葛根素、槲皮素、木犀草素、丙烯酰胺、乙二醇二甲基丙烯酸酯、N-異丙基丙烯酰胺、偶氮二異丁腈，阿拉丁試劑(上海)有限公司；硅膠，青島海洋化工有限公司；甲醇，天津市富宇精細化工有限公司；乙酸，國藥集團化學試劑有限公司；溴化鉀，天津市大茂化學試劑廠.

1.2 儀器與設備

2X15-3型恒溫加熱磁力攪拌器，上海司樂儀器有限公司；DHG-9146A型電熱恒溫鼓風干燥箱，上海精宏實驗設備有限公司；SHB-B95型循環水式多用真空泵，鄭州長城科工貿有限公司；SQP型電子天平，賽多利斯科學儀器(北京)有限公司；BSD-TX318型恒溫振蕩器，上海博訊實業有限公司醫療設備廠；TG16-WS型臺式高速離心機，長沙高新技術產業開發區湘儀離心機儀器有限公司；UV-1780型紫外可見分光光度計，島津儀器(蘇州)有限公司；KQ5200B型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；Quanta250型電鏡掃描儀，美國FEI公司；Nicolet-iS10型紅外光譜儀，美國Thermo Fisher公司.

1.3 分子印跡聚合物的制備

表1為分子印跡聚合物的合成用料比.以MIP2為例，其制備原理如圖1所示，模板分子葛根素與功能單體丙烯酰胺(AM)、溫敏單體(NIPAM)溶于50 mL甲醇中，室溫下反應30 min，使二者以氫鍵形式充分結合，之后加入交聯劑二甲基丙烯酸乙二醇酯(EGDMA)于70 ℃下充分溶解混合，通氮氣除氧15 min后加入AIBN引發劑，繼續氮氣保護下反應5 h得到聚合物，抽濾烘干后，以體積比為9∶1的甲醇-乙酸溶液為溶劑抽提24 h，再用新鮮的甲醇洗滌三次以除去模板分子和殘遺的乙酸，干燥后即得葛根素溫敏分子印跡聚合物.非分子印跡聚合物NIP2制備方法類似，過程中不加入葛根素模板分子.

表1 聚合物的合成用料量

圖1 葛根素溫敏分子印跡聚合物制備原理

1.4 表征與測試

1.4.1 分子印跡聚合物結構表征

采用紅外光譜(FTIR)分別對模板分子、NIP、洗脫前后MIP進行表征，溴化鉀為背景，檢測4 000～400 cm-1波數范圍內的紅外信號以確認對比相應官能團；利用掃描電鏡(SEM)對NIP、洗脫前后MIP表面形貌進行觀察，測試前樣品進行噴金處理.

1.4.2 分子印跡吸附實驗

(1)標準曲線繪制

移液槍準確移取濃度為0.48 mg/mL的葛根素-甲醇標準母液0.30 mL于25 mL容量瓶中，甲醇稀釋，搖勻.使用紫外分光光度計，于200～400 nm之間，測量吸光度(A)，取最大吸收波長λmax205.50 nm.移液槍分別量取0.15 mL、0.20 mL、0.25 mL、0.30 mL、0.35 mL、0.40 mL、0.45 mL的0.48 mg/mL的葛根素標準溶液于7個25 mL量瓶中，甲醇定容.在所選定的λmax下，測定溶液的吸光度值，以吸光度對濃度進行回歸分析，得到葛根素標準曲線回歸方程，并繪制標準曲線.同理，繪制槲皮素-無水乙醇溶液和木犀草素-無水乙醇溶液的標準曲線.

(2)等溫吸附實驗

稱取5組MIP和NIP各20 mg于5 mL離心管中，用移液槍分別吸取4 mL濃度為0.4 mg/mL、0.6 mg/mL、0.8 mg/mL、1.0 mg/mL、1.2 mg/mL的葛根素-甲醇溶液，密封，30 ℃下于恒溫振蕩器中吸附4 h，取上清液，采用紫外可見分光光度法，測定吸附后的溶液中葛根素的濃度并做好記錄，根據吸附前后葛根素濃度的變化，使用公式(1)可以計算分子印跡聚合物的吸附量.

Q=(C0-Ceq)V/M

(1)

式(1)中：Q，分子印跡聚合物對底物的吸附量(mg/g)；C0，吸附前的底物濃度(mg/mL)；Ceq，吸附平衡時的底物濃度(mg/mL)；V，吸附液的總體積(mL)；M，分子印跡聚合物的質量(g).

(3)不同溫度吸附

與“等溫吸附實驗”同法操作，配制適宜濃度的葛根素-甲醇吸附液，調節恒溫振蕩器中的溫度(30 ℃、40 ℃、50 ℃)，測定吸光度值，用公式(1)計算吸附量.

(4)選擇性吸附

分別配制濃度為1.0 mg/mL的葛根素-甲醇溶液、木犀草素-甲醇溶液、槲皮素-甲醇溶液作為吸附液，用紫外可見分光光度計測定吸光度后，根據工作曲線算出吸附后溶液中所含底物的濃度，以此計算出印跡聚合物對各物質的吸附量Q、分配系數kd及對葛根素的選擇系數k.

kd=Q/C

(2)

k=kdi/kdj

(3)

式(2)、(3)中：kd，分配系數，mL/g；Q，平衡時MIP對底物分子的吸附容量，mg/g；C，吸附平衡時溶液中底物分子的質量濃度，mg/mL；i、j，目標分離物葛根素及其干擾物，當i=j時，k=1.

1.4.3 分子印跡洗脫實驗

根據1.4.2節所述的操作方法，配制濃度為1.0 mg/mL的葛根素-甲醇吸附液，平行稱取多份等量(20 mg)的MIP1和MIP2，待吸附4 h達到平衡狀態后，離心，取沉淀物進行干燥；對吸附平衡的聚合物進行洗脫，以4 mL的甲醇為洗脫液，分別放入30 ℃、40 ℃、50 ℃恒溫振蕩器中，振蕩1 h后，離心，取上清液；每個樣品于每個溫度下進行三次平行洗脫實驗，通過紫外可見分光光度法測定吸光度，計算洗脫液濃度并最終求得平均洗脫率.

2 結果與討論

2.1 分子印跡聚合物結構表征

2.1.1 紅外光譜分析

如圖2所示，葛根素和未洗脫的MIP2的紅外光譜圖對比知，未洗脫的MIP2在3 172.82 cm-1處出現明顯的締合峰，且峰較寬，伸縮振動區域也出現了葛根素和NIP2的特征峰，以此說明MIP2中的功能單體與模板分子通過氫鍵的形式結合，且葛根素的吸收峰發生了一定的紅移；此外，NIP2和洗脫后的MIP2圖譜對比可知，基團的吸收峰位置、形狀、強度基本相似，說明MIP2中的模板分子已經被洗脫出去.

圖2 聚合物的紅外光譜圖

2.1.2 掃描電鏡(SEM)圖像分析

如圖3所示，通過掃描電鏡對NIP2、洗脫前的MIP2、洗脫后的MIP2的表面形貌進行觀察，可以看到所得聚合物材料呈現出不規則的顆粒狀，顆粒大小在200～800 nm之間；其中非印跡聚合物NIP2和洗脫前的印跡聚合物MIP2的表面較規整、光滑，洗脫后的MIP2顆粒形狀更加不規整，且表面粗糙度增加，空穴細度更小，說明長時間的抽提可將聚合物表面的模板分子洗脫，留下其結構空穴，作為印跡位點.

圖3 聚合物的掃描電鏡圖

2.2 葛根素溫敏分子印跡聚合物吸附性能

2.2.1 標準曲線繪制

如圖4所示，通過線性擬合得到葛根素-甲醇溶液的標準曲線方程為y=0.087 132 5x-0.033 862 6，R2=0.998 9，說明在選定濃度范圍內，葛根素濃度與吸光度呈現良好的線性關系.用相同方法測定木犀草素-乙醇溶液和槲皮素-乙醇溶液的標準曲線方程分別為y=0.123 9x-0.006 9，R2=0.999 7和y=0.130 791x-0.062 551 2，R2=0.999 6，均具有良好的線性關系.

圖4 葛根素標準曲線圖

2.2.2 等溫吸附實驗

MIP、NIP的等溫吸附曲線結果如圖5所示，隨著葛根素-甲醇溶液濃度的升高，分子印跡聚合物對葛根素的吸附量也逐漸增大，尤其是在0.4～0.8 mg/mL的濃度范圍內，吸附量的增加速率明顯，以MIP2為例，在0.4 mg/mL的濃度下，其吸附量為14.47 mg/g，當濃度增大到0.8 mg/mL時，吸附量變為39.19 mg/g，增量達到一倍以上.但是，當葛根素溶液的濃度達到一定值后，隨著濃度的繼續增大，MIP吸附量的增加速率變小，并逐漸趨于平緩，如MIP2的濃度從1.0 mg/mL增大到1.2 mg/mL時，其吸附量僅從45.51 mg/g增加到46.24 mg/g，這是因為同等質量下，MIP的空穴數量是一定的，在吸附液濃度較低時，葛根素能夠迅速地結合到MIP的空穴上，隨著濃度的增大，一部分的葛根素首先與聚合物表面上具有一定空間結構的空穴結合，另一部分則需要進入聚合物的內部與深孔結合，在這過程中需要克服一定的傳質阻力，最終導致吸附量的增加速率較小，尤其是當濃度增加到1.0 mg/mL時，吸附量慢慢趨向于平衡，說明聚合物對葛根素的吸附接近飽和狀態.

圖5 不同濃度下NIP與MIP的吸附量

此外，從圖5還可以看出，MIP對葛根素的吸附量總是大于NIP，說明MIP上具有與葛根素相吻合的空間結合位點，對葛根素有高度親和力和特異性識別能力，而NIP上由于沒有葛根素的特異性結合位點，故不會對葛根素有特異性吸附，只是簡單地與聚合物表面的一些隨機產生的空穴發生非特異性結合，所以對葛根素吸附量總是會低于MIP.

為了進一步探究MIP與葛根素的結合特征，我們采用經典的采用經典的Langmuir和Freundlich模型對等溫吸附數據進行處理.Langmuir 模型方程表達式為：

(4)

Freundlich 模型方程表達式為:

(5)

式(4)、(5)中：Qm，一定溫度下聚合物的飽和吸附量，mg/g；k1，Langmuir 常數，mL/mg；kf、n，經驗常數；Ce，葛根素的平衡濃度，mg/mL；Qe，平衡吸附量，mg/g.

擬合數據如表2所示，Langmuir等溫吸附模型中，線性關系較為理想，表明葛根素分子印跡聚合物基本以表面單層分子吸附方式為主.葛根素MIP1和MIP2的等溫吸附過程與Freundlich等溫吸附模型也較為相符，擬合曲線對應的1/n值遠小于200，一般認為，1/n反映吸附過程的難易程度，當1/n>200則是難以吸附過程，由此可見，所得分子印跡聚合物對葛根素的吸附非常容易，且隨著底物濃度增加平衡吸附容量(Qe)變化較小.

表2 Langmuir和Freundlich等溫吸附模型參數

2.2.3 溫度對吸附性能的影響

溫度對分子印跡聚合物吸附性能的影響如圖6所示，在30 ℃條件下，MIPs對葛根素的吸附量最高，隨著溫度的不斷升高，吸附量逐漸下降，其中加了溫敏單體NIPAM的MIP2和NIP2變化更為明顯，表現出更強的溫度響應性.以葛根素溫敏分子印跡聚合物MIP2為例，當溫度從30 ℃升高到50 ℃時，其吸附量從45.51 mg/g下降到27.30 mg/g，下降率達到40%.這是因為，在不同溫度下，溫敏單體NIPAM的親疏水作用不同，溫度升高時，NIPAM與溶劑結合的氫鍵會發生斷裂，原印跡空穴中的溶劑被釋放，導致空穴收縮，葛根素無法進入空穴，進而使吸附量降低.此外，同一溫度下，MIP的吸附量總是大于對應的NIP，進一步表明MIP上存在著與葛根素類似的空間結合位點，能對葛根素產生特異吸附.

圖6 不同溫度下NIP和MIP的吸附量

2.2.4 選擇性吸附性能

為了進一步突出MIP高度分離選擇性的特點，本實驗選取了葛根素結構相類似的化合物木犀草素和槲皮素作為吸附底物，其結構式如圖7所示，在其他條件相同的情況下，對它們進行靜態吸附實驗，考察MIP對葛根素的專一識別能力.

圖7 化合物的結構圖

從圖8所示的選擇性吸附測試結果可知，在30 ℃下，MIP2對葛根素的吸附量為45.51 mg/g，遠遠大于對木犀草素(20.29 mg/g)和槲皮素(8.10 mg/g)的吸附量，MIP1對三種化合物的選擇性也與MIP2相似.表3列出了MIP對不同底物的分配系數及選擇性系數，通常情況下，kd越高，表示聚合物對該底物的結合量越大，k越大，表示該聚合物對底物的選擇性越好.葛根素的分配系數遠高于槲皮素和木犀草素，同時相比于槲皮素和木犀草素，MIP1對葛根素的選擇性系數可分別達到4.19和2.63，MIP2的為6.87和2.62，由此說明MIP對葛根素具有良好的吸附能力和選擇識別能力.

圖8 MIP1和MIP2對葛根素(Puerarin)、木犀草素(Luteolin)、槲皮素(Quercetin)的吸附量

表3 選擇性吸附實驗結果

2.3 葛根素溫敏分子印跡聚合物洗脫性能

如圖9所示，吸附飽和的MIP1和MIP2洗脫率均隨著溫度的升高而增大，但MIP2的增幅明顯大于MIP1，50 ℃時，MIP2洗脫1 h后的平均釋放量為38.35 mg/g，平均洗脫效率為84.3%，遠高于MIP1的53%，這是由于MIP2中具有溫敏單體NIPAM，其在溫度刺激下與模板分子及溶液之間的氫鍵作用變化更為明顯，在高溫時，AM、NIPAM與葛根素之間的氫鍵更容易發生斷裂，導致印跡空穴發生膨脹，進而利于葛根素的釋放.

圖9 不同溫度下MIP1和MIP2的洗脫率

3 結論

(1)以葛根素為模板分子、丙烯酰胺為功能單體、N-異丙基丙烯酰胺為溫敏單體，成功合成了葛根素溫敏分子印跡聚合物.該印跡聚合物表面粗糙、粒徑大小均勻、質地疏松，提高了葛根素的結合率.

(2)MIP2表現出對葛根素較高的特異性吸附能力，當吸附液濃度為1 mg/mL時，其吸附量可達45.51 mg/g；通過擬合，分子印跡聚合物對葛根素的吸附過程符合Langmuir和Freundlich模型；且溫敏單體的加入使得印跡聚合物具備溫度響應行為，呈現出低溫利于吸附、高溫利于洗脫的特點.

綜上所述，本文提出和建立了葛根素溫敏分子印跡聚合物的制備方法，為中藥成分葛根素的提取分離提供了一種新型材料，同時也為分子印跡技術在中藥活性成分提取分離中的應用提供參考.