植物-微生物燃料電池對土壤中納米氧化鋅及鋅離子擴散的阻截效應

朱 超，王曼婷，張亞文，張春平，馬靚琛，李亞娟

(1.陜西科技大學 環境科學與工程學院，陜西 西安 710021；2.中國建筑材料工業建設西安工程有限公司，陜西 西安 710065；3.上海工程技術大學 化學與化工學院，上海 201600)

0 引言

由于納米材料被廣泛應用于商業用途，在納米材料和納米產品的生產、使用和處理過程中，納米材料難免會通過各種途徑進入環境，導致了潛在的重金屬離子污染風險，尤其是對土壤生態有顯著的影響.金屬離子釋放是金屬氧化物工程納米材料生態風險的主要貢獻者之一，為了控制金屬離子的釋放轉運，尋求一種經濟簡便的控制或修復技術來解決金屬納米顆粒暴露帶來的一系列土壤生態問題對于環保和可持續發展具有重要意義.

納米氧化鋅是廣泛流行在土壤系統對環境和人體健康最有毒的重金屬之一.它對細菌細胞、植物細胞及人體細胞有一定的毒性效應，ZnO-NPs進入細胞體內后，可使胞內代謝系統發生紊亂、生物化學成分發生改變，使菌死亡[1-4].在土壤修復領域去除納米氧化鋅顆粒是一個重大的挑戰[5].

植物微生物燃料電池(P-MFC，Plant Microbial Fuel Cell)是一項通過植物生理作用強化MFC的技術[6].植物通過光合作用將空氣中的二氧化碳轉化成有機物，其中大部分有機物由植物根系分泌至根際環境中.這些物質包括糖類、有機酸、酶和一些其他細胞物質，以及乙烯和二氧化碳等氣態物.在胞外電子呼吸菌的作用下，這些物質被轉化為電子、質子和二氧化碳，陽極生物膜的微生物可通過多種方式將電子跨細胞膜傳到體外，而電子通過導線傳遞至陰極.由此，陰陽兩極之間形成電位差，并產生電流和電場[7-9].多數P-MFC相關研究側重于提高陽極和陰極傳輸效率或降低P-MFC的內部電阻從廢水中收獲更多的能量或營養物質，關于利用P-MFC作為土壤重金屬污染修復應用的信息極為有限[10].有研究表明植物通過根系釋放的分泌物可以作為MFC的電子供體，提高電流產量，進而利用電化學還原將六價鉻轉化為三價鉻是土壤和沉積物中六價鉻去除的主要機制[11].但對于利用P-MFC在土壤中形成的微電場阻控金屬離子的流轉遷移和納米金屬氧化物的離子釋放還缺少系統深入的研究.故本研究提出將P-MFC應用于金屬氧化物工程納米顆粒源金屬離子的控制，對于P-MFC在環境重金屬污染治理方面提供更多理論和技術依據.

1 實驗部分

1.1 實驗材料

1.1.1 土壤

本試驗所用土壤取自西安市長安區西留村水稻種植地，是典型的單季稻和雙季稻種植地.土壤取自0～20 cm的表層土壤，經自然風干后，去除雜質，過2 mm篩，備用.

1.1.2 植物

本研究選擇根系發達的水生草本植物白鶴芋為供試植株，進行P-MFC的搭建.

1.1.3 實驗藥品

本實驗主要藥品有納米氧化鋅，1∶1硫酸、2,3,5-三苯基四氮唑氯化物(TTC)、65%～68%硝酸、(羥甲基)氨基甲烷，購自于西安拉卡儀器設備有限公司，均為分析純.

1.2 實驗方法

1.2.1 P-MFC搭建

試驗反應器如圖1所示.納米氧化鋅污染土壤P-MFC裝置其主體部分采用內徑15 cm，高度15 cm的透明玻璃圓桶，陽極和陰極都選用高純耐高溫石墨氈，陽極尺寸大小10 cm×10 cm×0.5 cm，陰極尺寸大小3 cm×10 cm×0.5 cm.用篩選的土壤進行MFC的搭建，在圓桶底層覆土4 cm，將陽極用銅導線穿好，使用去離子水潤濕后放入圓桶緊貼土壤表面，然后覆土2 cm，將陰極用銅導線穿好緊貼土壤表層，種植3棵健康狀況良好、單株生物量相近的白鶴芋，最后利用銅導線將陰陽兩極連接起來，外接 1 000 Ω大小的電阻.每天保持上覆去離子水1～2 cm保證陰極濕潤，外端接電壓采集器，采集P-MFC的電壓數據.

圖1 P-MFC系統搭建和作用機制示意圖

本次試驗共設五組不同處理裝置進行對比，如圖2所示.1號為簡單的模擬無植物土地，2號為天然白鶴芋種植地，3號為單陽極植物-微生物燃料電池，4號為雙陽極植物-微生物燃料電池，5號為微生物燃料電池，沒有植物的參與.

圖2 五組不同處理裝置對比圖

1.2.2 裝置的運行

將五個裝置置于生物培養箱中，保持土壤表面始終淹水1～2 cm，溫度控制在26±1 ℃，燈光照射控制在十個小時左右，每天對電流、電壓、內阻、室溫、濕度及pH進行測量和記錄.實驗進行十天后，電流增長并穩定在50 mA左右表示P-MFC啟動，即可以進行暴露實驗.

1.2.3 納米氧化鋅暴露設置

P-MFC啟動后，給每個裝置加入700 mg/kg的納米氧化鋅，準確稱量五份納米氧化鋅，溶于水后，使用變幅桿超聲發生器進行充分混勻，以噴淋的方式，一次性加入各裝置中.

1.2.4 土壤pH的測定

使用土壤pH計酸堿度測試儀測定待測土壤的pH值，型號為ZD-06，測定前，先用研磨布或清潔棉擦拭金屬探頭的部位，以防影響測定值，將儀器的金屬探頭順時針垂直插入土樣中下部進行測定，待讀數穩定5～10 s后進行讀數.

1.2.5 土壤微生物代謝活性測定

采取氧化鋅工程納米顆粒暴露前五天的土樣以及氧化鋅工程納米顆粒暴露五天后的土樣，過2 mm孔篩，選擇兩種對土壤生化過程有重要作用并且可能對ZnO-NPs敏感的酶，兩種酶為熒光素二乙酸酯水解酶(Luciferin diacetate hydrolase FDAH)和脫氫酶(Dehydrogenase DH)，每種測定做三個平行，采用比色法測定FDAH 活性和DH活性[10].

1.2.6 植物生物量和抗氧化酶活性測定

將植株連帶栽培土壤整體取出花盆浸入水中，洗凈植物表面及根下部，用去離子水清洗植物三次，濾紙擦干.每個處理裝置取3株植物，做三次平行，將植物分為根、莖葉兩個部分分別裝于信封中在105 ℃下殺青30 min，將殺青后的植物于65 ℃下烘干至恒重，并稱取各部分重量即為干重[12].

本研究選取的抗氧化酶活性(Antioxidant Enzyme Activity，AEA)評價系統由超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)和過氧化物酶(POD)構成，均采用基于比色法的試劑盒(南京建成公司A001-3、A007-1、A084-1)進行測定.

1.2.7 鋅元素分布測定

(1)土壤淋濾液的制備

本次實驗用兩種浸提液做對比，一種為水，模擬正常雨水的淋濾，一種為弱酸溶液，模擬酸雨成分制備，分別進行24 h的濕沉降.以水為淋濾液制備土壤浸提液的方法：準確稱量5 g干燥的土壤樣品，放入100 mL干燥的錐形瓶中，加入95 mL蒸餾水，劇烈震蕩2 h，靜置24 h，上清液即為土壤浸提液.以弱酸為淋濾液制備土壤浸提液的方法只需將蒸餾水換成酸溶液(20 mL的硫酸、4 mL的檸檬酸、1.44 mL的硝酸混合，加水調節pH到4)，上清液為土壤弱酸浸提液.

(2)ICP-AES測土壤中的鋅濃度

將制備好的土壤浸提液取15 mL稀釋到30 mL進行超速離心(離心前要將浸提液進行恒重)，另取10 mL未離心浸提液，將離心后的和未離心的溶液用0.45 μm濾膜過濾，過膜后，用ICP-AES測鋅元素濃度，并記錄兩次沖洗Zn2025、Zn2062、Zn2132的平均值.

2 結果與討論

2.1 P-MFC啟動分析

圖3和圖4為燃料電池電流分析圖和電壓分析圖.0～15天為啟動期，及陽極生物膜形成階段[11]，在此階段，電流和電壓大幅度上升且各系統電壓變化幅度較大，3號處理的輸出電流從6 mA提升到35 mA，4號和5號從2 mA提升到22 mA，三個處理的輸出電壓分別從3 V、1.5 V、1.5 V提升到11 V、10 V、8 V；電位上升可能是因為閉合回路的形成使得陽極產電菌不斷富集，分解土壤中已有的有機質，導致土壤中有機質含量降低，陽極電位升高[13].

圖3 不同P-MFC處理的電流輸出比較

圖4 不同P-MFC處理的電壓輸出比較

隨著系統運行時間的增加，陽極周邊的有機質易于被微生物消耗完全，而底泥傳質隨時間具有不確定性，所以導致電壓變化幅度較大[14]，圖5為啟動前后陽極石墨氈表面的生物膜生長情況.15～20天電流和電壓小幅度上漲，3、4、5號處理組電流從35 mA、22 mA、22 mA提升到48 mA、46.5 mA、41 mA，電壓從11 V、10 V、8 V提升到17.5 V、17 V、16 V，20天之后電流電壓值保持穩定.這與通過構建MFC來修復受重金屬污染土壤的電流電壓變化趨勢相一致[15].從整體運行水平來看，3、4、5號處理組最大電流密度分別為230.4 mW/m2、220.9 mW/m2、168.1 mW/m2，表1為不同植物用作P-MFC所產生的最高功率密度之間的對比，可以得到以白鶴芋為植株所搭建的P-MFC產生的電流密度居于中等偏上水平[16].

表1 不同植物用作燃料電池的功率密度

圖5 使用前后的陽極石墨氈表面照片

對三個處理組的電流和電壓進行顯著分析得出，3號和4號處理組輸出電流和電壓顯著高于5號處理組，這證明植物的引入對提高電池產電效能有一定的促進作用.也有相關研究表明有植物的MFC比沒植物的MFC有更強的功率和產電性能[17].3號、4號產電水平相當，說明4號設置兩層陽極對產電效果并無影響.采樣后對白鶴芋根系進行了測量，根系長度大多在10 cm左右.有電極的植物與普通花盆里種植的植物并無差別，這表明在土壤中搭建植物-微生物燃料電池并不影響植物的生長狀況.

2.2 P-MFC運行對土壤基本性質的影響

2.2.1 對土壤pH的影響

P-MFC啟動后，每天對土壤pH進行測定，納米氧化鋅暴露前5天和暴露后5天的土壤pH基本無變化，土壤pH一直保持在6.3～6.8之間，P-MFC運行階段土壤始終保持1～2 cm淹水面，在加純水后pH會有小的波動，其原因有可能是因為純水的加入增大了土壤環境中H+的濃度，H+通過離子交換膜從陽極室遷移到陰極室，納米氧化鋅在陰極被還原為鋅單質，導致陰極室pH增大，由于電極間距較小，H+的傳質距離較短，傳質受到限制較小，使pH波動范圍依舊在6.3～6.8之間.

2.2.2 對土壤酶活性的影響

土壤的微生物生態功能是衡量土壤基本性質的一個重要方面[22]，土壤酶活性可以被用作土壤生態脅迫或土壤生態恢復等早期的敏感性指示[23,24].本研究選取FDAH和DH活性.FDAH與總碳、總氮和總磷等土壤養分指標關系密切，能夠很好地反映系統間有機質的轉化及土壤中微生物的活性[25].DH存在于微生物細胞內，是典型的胞內酶，其活性的大小直接反映土壤微生物的數量和活性[26].

圖6和圖7分別顯示不同處理土壤在ZnO-NPs暴露后的FDAH和DH活性的變化.由圖6、7可知，在ZnO-NPs暴露前體系下，五種不同處理組的FDAH活性和DH活性大小無特大差異，2號有植物無電極裝置的FDAH和DH活性都略低于3號和4號有植物有電極裝置.在ZnO-NPs暴露后，3號單陽極P-MFC的FDAH活性最高，4號雙陽極P-MFC的DH活性最高，二者活性都高于5號無植物MFC.1號和5號無植物裝置的FDAH活性在ZnO-NPs暴露后分別降低約24%、19%，DH活性降低約42%、31%，二者活性在ZnO-NPs暴露后有顯著性差異；2、3號有植物裝置的FDAH活性在ZnO-NPs暴露后分別升高約0.2%、0.48%，4號裝置的DH活性升高約0.52%，這證明植物的存在能夠顯著提高納米氧化鋅脅迫下土壤的酶活性.植物根系巨大的比表面積為微生物提供了良好的生長環境，促進了根際環境微生物的多樣性與活性[27].這與現有研究表明的P-MFC比MFC有更高的酶活性相一致[28].

圖6 ZnO-NPs暴露后不同設置土壤的FDAH活性比較

圖7 ZnO-NPs暴露后不同設置土壤的DH活性比較(“*”表示暴露前后的差異顯著性(p<0.5))

2.2.3 P-MFC對暴露于ZnO-NPs下植物生長的影響

不同處理ZnO-NPs暴露前5天和暴露5天后植物生物量比較如圖8所示.可以看出，ZnO-NPs暴露前后植物根莖葉占比無顯著差異.實驗結束后，不同P-MFC處理組白鶴芋植株干重平均為10.52±1.37 g，在各個不同處理之間沒有顯著差異.其中產電最為活躍的3號單層陽極的P-MFC白鶴芋植株重10.67±1.37 g，4號雙層陽極的P-MFC白鶴芋植株重10.13±1.37 g，自然生長的白鶴芋植株干重為10.43±1.37 g.白鶴芋穿過第二層石墨氈的根系相對第一層較少.在整個裝置運行階段，并未觀察到產電過程對白鶴芋生長，葉片顏色、大小及根系的長度有顯著影響，表明在土壤中構建微生物燃料電池不會影響現有作物的生長，石墨氈電極和導線保持了物理化學穩定性，這與現有研究保持一致[29].

圖8 納米氧化鋅暴露前后不同PMFC處理下植物生物量比較

圖9為不同P-MFC處理下植株的抗氧化酶系變化情況.植株通過超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、過氧化物酶(POD)等各抗氧化酶的協同作用，可把環境脅迫下細胞內產生的具有很強氧化活性的活性氧如H2O2、OH·等直接或間接地清除，防止了活性氧的級聯放大作用[30,31]，在植物生命活動中起著舉足輕重的作用，同時可作為環境脅迫強度的衡量指標.

由圖9可以看出，運行體系的植株樣本的AEA值顯著高于對照，且都表現為“先升后降”.這是由于在超出細胞承受能力后細胞膜脂過氧化程度加深，細胞受到的傷害增強，影響了細胞內蛋白質等物質的合成，因此抗氧化酶活性下降[32,33].SOD的活性較CAT和POD活性高出很多，這一方面由于SOD是歧化超氧自由基的催化酶，之后CAT和POD才將歧化產生的H2O2轉化為H2O和O2.同時說明SOD在白鶴芋耐受ZnO-NPs脅迫中起主要作用.在無P-MFC設置土壤中，SOD和CAT的活性都有顯著增加，反映了植株對ZnO-NPs暴露所表現的氧化應激作用，而在P-MFC設置中的根部區域土層中，AEA體系并未發生明顯變化，證實P-MFC處理能夠有效弱化納米氧化鋅對土壤植物的氧化脅迫效應，當然，較之對照，ZnO-NPs暴露還是造成了植株AEA體系活性水平的上升，說明該情境下的ZnO-NPs暴露對于植株有確定的低劑量刺激效應[34]，再次印證了P-MFC在弱化納米金屬顆粒土壤暴露對植株毒性效應方面的作用.

圖9 不同P-MFC處理下植株的AEA變化

2.3 P-MFC對于ZnO-NPs土壤行為的影響

通過ICP-AES測定在濃度為700 mg/L的ZnO-NPs暴露下各P-MFC的土壤浸提液中的Zn2+濃度，結合不同土層中的微生物生長情況，分析ZnO-NPs顆粒在不同處理中的擴散情況.不同處理中各層土壤鋅元素濃度有所差異，淋濾液經過超速離心后，以ZnO-NPs形態存在的Zn元素被沉在離心管底部，用ICP-AES測上清液中Zn元素濃度，所得數值即為暴露在土壤中的納米氧化鋅轉化為離子形態的濃度.

圖10為在水淋濾和弱酸淋濾處理下不同裝置Zn元素在不同土壤層分布的情況.由圖10(a)可知，五個處理組在離心和未離心的水淋濾液以及弱酸淋濾液中的Zn元素濃度在1 cm土層最高，且隨著土層的加深，Zn元素濃度越低.其中，3號單層陽極P-MFC和4號雙層陽極P-MFC表層土壤中Zn2+濃度與其它三組處理相比，濃度高出2倍以上，但到上層4 cm處單層陽極和雙層陽極P-MFC的Zn2+濃度均低于其它三組處理，圖10(b)的3、4號處理在1 cm土壤層Zn元素濃度可達180 mg/L、140 mg/L，在4 cm兩者只有約5 mg/L，1、2、5號處理在1 cm土壤層Zn元素濃度可達30 mg/L、70 mg/L、80 mg/L，在4 cm處達25 mg/L、30 mg/L、10 mg/L，在7 cm處Zn元素濃度幾乎為零.與4 cm土壤層相比，其單陽極及雙陽極P-MFC的Zn元素濃度有96.8%被截留在1 cm土壤上層，無植物無電極的處理裝置Zn元素濃度有16.7%、被截留在1 cm土壤上層，其截留率較之對照提升了82.7%，這說明設置P-MFC的處理可以將部分納米氧化鋅工程顆粒的Zn2+阻截在土壤層，而未設置植物的MFC和只有植物無電極以及無植物無電極的處理中Zn2+相對向下擴散，阻截效應相比P-MFC不夠明顯.

圖10(c)為離心后水淋濾液中Zn2+濃度，大多數暴露的納米氧化鋅顆粒被阻截在土壤表層中.圖10(d)為離心后弱酸淋濾液中鋅元素濃度分析圖，與圖10(c)相比，對暴露在土壤表層中的納米氧化鋅轉化成的離子態鋅的阻截效應更加明顯，圖10(d)的單陽極和雙陽極P-MFC在陰極附近的Zn元素濃度相比上層4 cm處，其截留率約為98%，只有植物無電極以及無植物無電極的P-MFC截留率約83%，可以得到P-MFC有顯著降低Zn2+向下層土壤遷移釋放的作用.

圖10 水淋濾和弱酸淋濾處理下土壤層不同裝置Zn元素分布

圖11為各處理裝置每層土壤Zn元素濃度對比分析圖.其中，黃色深淺代表Zn元素含量的大小，紅色下方土壤中Zn元素含量與無植物無電極的1號土壤Zn元素含量基本相同.單陽極和雙陽極P-MFC處理的Zn元素明顯被阻截在上層土壤，Zn元素集中在水和土壤的交界面陰極層中，靠近陰極的地方集中最多Zn元素，而其它裝置ZnO-NPs不同程度的擴散到下層土壤.這說明在P-MFC上陽極產生的電子相對而言更易被土壤中的金屬離子這些電子受體接收，從而達到固化土壤中的金屬離子的作用，將土壤中的納米氧化鋅阻截在陰極附近[27].

圖11 各土壤層不同裝置Zn元素分布

3 結論

為了探究P-MFC對土壤中金屬顆粒的阻截效應，以及P-MFC產電的可利用價值，本論文分別構建了雙層陽極P-MFC、單層陽極P-MFC、MFC、普通白鶴芋種植及無植物種植裝置，經過試驗得出以下結論：

(1)在系統運行的20天內，單陽極P-MFC、雙陽極P-MFC以及無植物MFC處理組均能維持較穩定的產電，在整個運行階段輸出電壓整體穩定在15～18 V，電流穩定在50 mA左右，植物的引入可以提升MFC的產電性能且P-MFC的搭建對植株的正常生長不產生影響.

(2)植物的存在和電池的通入能夠顯著提高ZnO-NPs脅迫下土壤的FDAH和DH活性及弱化土壤中納米金屬顆粒對植株的毒性效應.

(3)P-MFC可在24 h的運行周期下將濕沉降暴露的ZnO-NPs顆粒截留在1 cm土層處，4 cm處Zn2+濃度相比1 cm降低96.8%，7 cm土層以下Zn2+濃度為零，P-MFC對Zn2+的截留率較之對照組增加了82.7%，P-MFC對土壤中暴露的ZnO-NPs顆粒向下層土壤的遷移釋放起到一定的阻截效應.