基于離子色譜法測定乳及乳制品中亞硝酸鹽含量

張麗芳，張淼怡，劉宇奇，鄭百芹，周璇，谷守國

1. 唐山市食品藥品綜合檢驗檢測中心（唐山 063000）；2. 河北省農產品質量安全檢測工程技術創新中心（唐山 063000）；3. 唐山市功能性農產品產業技術研究院（唐山 063000）

乳及乳制品中含有豐富的蛋白質、脂肪、乳糖、維生素和礦物質等營養元素，在日常飲食中占據越來越重要的地位，其質量安全問題也越來越受到關注。亞硝酸鹽廣泛存在于土壤、地表水、植物和生物系統中。亞硝酸鹽與食品中固有的胺類化合物是產生亞硝胺的前體物質，亞硝胺在動物試驗中被證實為致癌物。大量攝入亞硝酸鹽可誘導高鐵血紅蛋白血癥，導致組織缺氧[1-2]。新生嬰兒對亞硝酸鹽非常敏感，且乳制品攝入量大。奶牛的養殖環境、飼養用水及飼料中亞硝酸鹽含量過高，有可能導致牛乳中的亞硝酸鹽含量超標[3]。因此對乳品中亞硝酸鹽進行安全監控十分必要[4]。

鑒于亞硝酸鹽對人體的危害性，各國制定食品中亞硝酸鹽的添加量和殘留量相關限量。世界衛生組織食品添加物聯合專家委員會規定：亞硝酸鹽每日攝取安全容許量為0～0.06 mg/kg[5]。GB 2762—2017《食品安全國家標準 食品中污染物限量》[6]規定：乳及乳制品中生乳的亞硝酸鹽（以亞硝酸鈉計）不得大于0.4 mg/kg；乳粉及特殊膳食用食品（嬰幼兒配方食品、嬰幼兒谷類輔助食品、孕婦及乳母營養補充食品等）亞硝酸鹽（以亞硝酸鈉計）不得大于2 mg/kg。

乳制品中亞硝酸鹽的常見檢測方法有分光光度法、液相色譜法、氣相色譜法、流動注射法、離子色譜法和液相色譜-質譜聯用法[7-10]。這些方法存在各自的優缺點，如：分光光度法操作復雜，引入鎘污染物，易對環境造成污染；氣相色譜法靈敏度不高，不能滿足乳制品的限量要求；離子色譜法作為無機陰離子分析技術，具有快速、靈敏、選擇性好等優點，但GB 5009.33—2016《食品安全國家標準 食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》[11]中離子色譜法前處理過程需要過柱，操作復雜，成本高。試驗采用離子色譜法測定乳及乳制品中亞硝酸鹽含量，通過優化前處理條件和篩選色譜分析參數，旨在建立一種準確、快速、低成本的檢測方法，為乳及乳制品中亞硝酸鹽的測定研究提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

亞硝酸根標準物質（1 000 μg/mL，北京北方偉業計量技術研究院）；乙腈（色譜純，DiKMA）。

1.2 儀器與設備

883 Basic IC plus離子色譜儀（瑞士萬通）；PL2002分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；LYNX4000高速低溫冷凍離心機（Thermo Scientific）；Gd-16高速均質機（新銳科技）。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

1.3.1.1 液態奶和乳飲料

稱取20 g樣品，精確至0.01 g，至50 mL準確量值的離心管中，加入乙腈定容至50 mL，充分渦旋振蕩，靜置10 min。樣品按10 000 r/min離心10 min。取液體過0.45 μm水相濾膜后上機。

1.3.1.2 奶粉

稱取5 g樣品，精確至0.01 g，至50 mL準確量值的離心管中，用20 mL水復溶，加入乙腈定容至50 mL，充分渦旋振蕩，靜置10 min。隨后，樣品按10 000 r/min離心10 min。取液體過0.45 μm水相濾膜后上機。

1.3.1.3 干酪

稱取2.5 g樣品，精確至0.01 g，至50 mL準確量值的離心管中，加入20 mL水，加入數粒陶瓷珠，高速勻漿2 min，超聲30 min，取出放置至室溫，加乙腈定容至50 mL，充分渦旋振蕩，靜置10 min。隨后，樣品按10 000 r/min離心10 min。取液體過0.45 μm水相濾膜后上機。

1.3.2 色譜條件

色譜柱Metrosep A Suup7-250/4.0；柱溫35 ℃；進樣量50 μL；淋洗液流速0.7 mL/min；淋洗液3.6 mmol/L Na2CO3。

1.3.3 標準溶液配制

1.3.3.1 標準儲備液

精確量取0.1 mL 1 000 μg/mL的亞硝酸鹽標準溶液至10 mL容量瓶中，用水定容至刻度，制備成10 μg/mL標準儲備液。

1.3.3.2 標準中間液

精確量取1.0 mL 10 μg/mL標準儲備液至10 mL容量瓶中，用水定容至刻度，制備成1 μg/mL的標準中間液。

1.3.3.3 標準曲線

精密吸取0.1，0.2，0.4，0.8，1.0和2.0 mL標準中間液分別至10 mL容量瓶中，用水定容至刻度，制備成0.01，0.02，0.04，0.08，0.10和0.20 μg/mL的標準曲線。

1.3.3.4 基質匹配標準曲線

精密吸取0.1，0.2，0.4，0.8，1.0和2.0 mL標準中間液分別至10 mL容量瓶中，用基質空白提取液定容至刻度，制備成0.01，0.02，0.04，0.08，0.10和0.20 μg/mL的基質標準曲線。

1.3.4 計算公式

試樣中亞硝酸鹽（以NO2-計）含量按式（1）計算。

式中：X為試樣中亞硝酸鹽含量，mg/kg；C為試樣中實測亞硝酸鹽質量濃度，mg/L；V為試樣溶液體積，mL；f為稀釋倍數；m為試驗質量，g。

2 結果與討論

2.1 前處理方法的選擇

2.1.1 樣品沉淀劑的選擇

乳及乳制品中測定亞硝酸鹽去除蛋白和脂肪的沉淀劑種類較多，如乙酸鋅+亞鐵氰化鉀、鎢酸鈉+硫酸、冰乙酸、冰乙酸+乙腈、三氯乙酸+乙腈、乙醇等。乙酸鋅+亞鐵氰化鉀對于乳制品有很好的蛋白沉淀效果，是液相色譜法和分光光度法常用的沉淀劑，但在離子色譜中這些沉淀試劑會引入大量金屬離子，污染色譜柱，降低離子色譜柱效[12-13]。乙酸沉淀法基線相對較平直，同時亞硝酸根不受乙酸根的影響，但在低體積分數時，亞硝酸鹽可能受pH影響加速轉化，使回收率偏低。

乙醇、乙腈是較為理想的蛋白沉淀劑，試驗發現乙醇的沉淀效果比乙腈的沉淀效果差，選擇乙腈作為蛋白沉淀劑。有機相與水相的比例會影響蛋白沉淀效果和回收率，比較乙腈與水相的體積比分別為7∶3，6∶4，5∶5，4∶6和3∶7時的沉淀效果和對亞硝酸根回收率的影響，結果見表1。在20 g液態奶或乳制品制備成20 mL液態試樣時，加入約30 mL乙腈（V乙腈∶V水=6∶4），蛋白沉淀效果最理想，未出現分層現象，回收率高，確定為蛋白沉淀的最佳條件。試驗以乙腈為沉淀劑，沉淀效果與回收率（回收率98.4%）均優于顏琪等[14]以1∶1的乙腈-3%乙酸為蛋白沉淀劑（回收率97.3%）。

表1 蛋白沉淀劑的選擇

干酪試樣在水中的溶解度低，樣品經高速均質后超聲提取，亞硝酸鹽回收率優于試樣加入水后直接超聲提取。對超聲提取時間進行優化，亞硝酸鹽回收率隨著超聲時間的延長而提高，到30 min后，回收率趨于穩定，因此確定超聲時間為30 min。

2.1.2 分離參數的優化

試樣經蛋白沉淀后，離心進行分離，以亞硝酸鹽的回收率為評價指標，篩選出離心轉速與時間，設計因素與水平見表2，所得結果見表3。隨著離心轉速的提高和時間的延長，蛋白分離效果變好，亞硝酸鹽的回收率提高后趨于平穩。結合操作時間綜合考慮，選擇10 000 r/min、離心時間10 min作為分離參數。

表2 離心轉速和時間對亞硝酸鹽回收率的影響試驗設計

表3 離心轉速和時間對亞硝酸鹽回收率的影響試驗結果

2.1.3 凈化參數優化

由于乳制品中的氯離子含量較高，奶粉中氯離子含量一般在800～1 000 mg/L[15]。按照GB 5009.33—2016，氯離子濃度大于100 mg/L時，待測液需要依次通過針頭濾器、C18柱、Ag柱和Na柱，去除或降低待測液中氯離子濃度，以降低對亞硝酸鹽的影響，但試驗結果顯示，亞硝酸根離子的回收率并未受到氯離子的影響，所得結果與馮偉科等[16]研究結果一致。試驗方法在離心去除蛋白后，上清液直接過濾膜上機，不再用Ag柱、Na柱處理，大幅降低檢測成本。

2.2 色譜條件的優化

試驗考察Metrosep A Suup4-250/4.0和Metrosep A Suup7-250/4.0色譜柱對亞硝酸鹽的分離效果。Suup4色譜柱采用的淋洗液為1.8 mmol/L Na2CO3和1.7 mmol/L NaHCO3，流速1.0 mL/min，亞硝酸根的出峰時間為5.20 min，但奶的基質有干擾峰，通過調節淋洗液和流速并未有所改善。Suup7色譜柱采用3.6 mmol/L Na2CO3為淋洗液，流速0.7 mL/min，亞硝酸根與雜質峰能得到很好分離，出峰時間14.4 min。提高淋洗液的離子濃度或流速，離子的保留時間會縮短，但不利于干擾離子與亞硝酸根的分離，流速的增加也顯著增大系統的壓力。綜合考慮，確定采用Metrosep A Suup7-250/4.0色譜柱，3.6 mmol/L Na2CO3為淋洗液，流速0.7 mL/min，作為試驗的色譜條件。標準溶液色譜圖和奶粉基質色譜圖見圖1。

圖1 標準溶液（A）和奶粉基（B）質色譜圖

2.3 基質效應

基質效應（Matrix effects，ME）是指樣品中除分析物以外的組分，在分析過程中對目標物有顯著干擾。基質效應影響大時會降低方法的靈敏度，影響方法的準確性，給測定帶來誤差[17]，因此，方法開發和確證過程中需要對基質效應做出評價。按照樣品的前處理方法分別制備液態奶、奶粉、干酪的基質空白提取液。分別用基質空白提取液和水配制系列濃度的標準溶液，按照試驗方法進行測定。一般認為，基質匹配校正曲線斜率與標準曲線斜率的比值在0.85～1.15之間不存在基質效應[18-19]。試驗液態奶、奶粉、干酪的基質效應分別為0.95，0.74和0.68，結果表明液態奶的基質效應較弱，而奶粉和干酪具有較強的抑制作用。分析原因是奶粉和干酪中除了蛋白質、脂肪和碳水化合物外，有多種不同種類的物質，如維生素類、無機鹽類、植物油類、添加劑等。因此，液態奶檢測采用標準曲線進行校正，奶粉和干酪采用基質匹配的標準曲線進行校正。

2.4 方法學確定

2.4.1 標準曲線、檢出限和定量限

選擇0.01，0.02，0.04，0.08，0.10和0.20 μg/mL標準工作液，按1.3.2的儀器條件進行測定。以峰面積Y（μs·min）為縱坐標，質量濃度X（μg/mL）為橫坐標，做標準曲線，以3倍信噪比確定檢出限，以10倍信噪比為定量限。所得線性方程、線性相關系數、檢出限和定量限見表4。

表4 標準曲線線性方程、相關系數、檢出限和定量限

2.4.2 方法的回收率與精密度

為驗證方法的可靠性，采用基質加標法對回收率和精密度進行考察，在液態奶、奶粉和干酪中添加標準溶液，制備成0.5，1.0和2.0 mg/kg這3個質量分數水平，每個添加水平6個平行。在低、中、高3個濃度條件下，回收率在85.4%～101.3%之間，精密度為1.5%～7.1%。試驗方法具有良好的回收率和精密度，能夠滿足檢測需求，結果見表5。

表5 方法的加標回收率及相對標準偏差（n=6）

3 結論

試驗方法適用于液態乳、乳粉及干酪乳制品中亞硝酸含量的測定。通過對前處理方法優化、流動相的選擇、色譜柱的比較、結果穩定等方面的討論，確定乳及乳制品中亞硝酸鹽分離提取及色譜分析的最佳參數：蛋白沉淀劑采用乙腈，與試樣的體積比6∶4，按離心轉速10 000 r/min、離心時間10 min分離蛋白，上清液經0.45 μm濾膜過濾，以3.6 mmol/L Na2CO3為淋洗液，流速為0.7 mL/min，進行色譜分析。方法的回收率為85.4%～101.3%，精密度為1.5%～7.1%，滿足檢測需求。奶粉和干酪樣品以基質匹配的標準曲線進行校正，降低基質效應對檢測結果的影響。該方法前處理方法簡單、成本低、檢出限低，優于國標方法，能夠滿足乳及乳制品中亞硝酸鹽的檢測要求，可為食品安全監督提供有效的技術支撐。