GeneXpert MTB/RIF檢測在涂陰性肺結核診斷及耐藥性檢驗中的應用

曹小九 李洪智 張曉琦

肺結核屬于常見的呼吸系統傳染性疾病，流行病學調查研究顯示[1]，我國肺結核的發病率呈逐年上升趨勢，且涂陰性肺結核占比高達85%，約13%的結核病傳播由涂陰性肺結核所引起，故對涂陰性肺結核進行早期診斷在結核病防治工作中具有重要意義。目前臨床上以抗酸染色和痰涂片作為涂陰性肺結核的主要診斷手段，但抗酸染色鏡檢方法的陽性檢出率和敏感度較低，而痰涂片鏡檢操作復雜，且培養時間較長，均難以實現對涂陰性肺結核的及時診斷[2]。隨著分子生物學技術的不斷發展，GeneXpert MTB/RIF 技術可在2h 內直接檢出是否含有結核分枝桿菌及該菌是否對利福平耐藥，近年來被逐漸應用于結核病診斷中[3]。但目前臨床上有關GeneXpert MTB/RIF 檢測涂陰性肺結核以及利福平耐藥性方面的報道較少，本研究對GeneXpert MTB/RIF檢測在涂陰性肺結核診斷和耐藥性檢驗中的應用價值做進一步分析。

1 材料與方法

1.1 一般資料選取2019年11月～2021年12月于我院就診的120 例疑似涂陰性肺結核患者為研究對象。其中男78 例，女42 例，年齡21～85 歲，平均（53.17±7.97）歲。納入標準：①出現咳嗽、咳痰、胸痛、乏力等肺結核典型臨床癥狀；②經影像學檢查，患者肺部有活動性肺結核病變。排除標準：①合并其他肺部疾病；②妊娠期或哺乳期女性。本研究已由我院醫學倫理委員會批準，受試者均自愿參與研究，且簽訂相關同意書，患者家屬獲有知情權。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集 患者入院后采集痰液3～5ml。若患者無法自然咳痰則對其采取霧化誘導措施進行排痰。取每份痰液標本的膿性部分做抗酸染色檢查，剩余的痰液標本各取1ml 進行GeneXpert MTB/RIF檢測和痰培養檢測。

1.2.2 痰培養檢測 在1ml 痰液中加入4%氫氧化鈉1ml，震蕩15～20s 后靜置15～20min。采用無菌吸管將痰液標本接種到MGIT 79 培養基中。然后將其置入全自動結核培養藥敏儀（型號：BACTEC MGIT960，廠家：Becton，Dickinson and Company）中。每周對培養結果進行報告和記錄，若痰液標本為陽性，儀器的紅色指示燈則會立即閃亮并出現提示音。

1.2.3 抗酸染色檢測 應用齊-內染色法對抗酸桿菌涂片進行檢測。結果判讀標準：結核分枝桿菌陽性（4+）：每個視野發現＞9 條結核分枝桿菌；結核分枝桿菌陽性（3+）：每個視野發現1～9 條結核分枝桿菌；結核分枝桿菌陽性（2+）：100 個視野發現＞9 條結核分枝桿菌；結核分枝桿菌陽性（1+）：300 個視野發現＞9 條結核分枝桿菌；結核分枝桿菌陰性（-）：300 個視野發現1～8 條結核分枝桿菌。

1.2.4 藥敏試驗 依據《結核分枝桿菌藥物敏感性試驗標準化操作程序及質量保證手冊》要求，將痰培養和抗酸染色中所有陽性標本接種至含有濃度為40μg/ml 利福平的羅氏培養基中進行藥敏檢測。在37℃環境下培養1 個月后對結果進行觀察。

1.2.5 GeneXpert MTB/RIF 檢測 采集患者痰液（1ml）后加入樣本處理液（2ml）在試管中予以混合，然后震蕩約30s，靜置15min 左右。使用GeneXpert MTB/RIF檢測專用的吸管將標本液體轉移至專用的樣本反應盒后整體放置于GeneXpert MTB/RIF 檢測儀中，儀器開始自動化檢測，約2h 后可直接讀取結果。其中GeneXpert MTB/RIF 對結核分枝桿菌和利福平耐藥的檢測結果分別為結核分枝桿菌檢出、結核分枝桿菌未檢出和利福平耐藥檢出、利福平耐藥未檢出。

1.3 統計學分析應用SPSS 21.0 軟件進行數據處理，計數資料以百分比表示，采用χ2檢驗，計量資料以±s表示，采用t檢驗，P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 三種檢測方法檢測涂陰性肺結核陽性率比較痰培養、抗酸染色、GeneXpert MTB/RIF 檢測涂陰性肺結核陽性率依次為35.00%、32.50%、83.33%。與痰培養和抗酸染色相比，GeneXpert MTB/RIF 檢測涂陰性肺結核陽性率較高，差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 三種檢測方法檢測涂陰性肺結核陽性率比較（n）

2.2 三種檢測方法對涂陰性肺結核診斷效能比較以臨床最終診斷為“金標準”，其中臨床最終診斷涂陰性肺結核101 例。與痰培養和抗酸染色相比，GeneXpert MTB/RIF 檢測涂陰性肺結核的敏感度、特異性、準確度均較高，且與臨床最終診斷的一致性最高，見表2。

表2 三種檢測方法診斷效能比較

2.3 三種檢測方法檢測利福平耐藥的效能比較以絕對濃度法藥敏試驗結果為“金標準”，其中絕對濃度法藥敏試驗鑒定利福平耐藥16 例。痰培養、抗酸染色、GeneXpert MTB/RIF 檢測利福平耐藥的陽性率依次為26.73%、27.72%、23.76%，三者比較差異無統計學意義（P＞0.05）。GeneXpert MTB/RIF 檢測利福平耐藥的敏感度、特異性、陽性預測值、陰性預測值、準確度依次為87.50%、88.23%、58.33%、97.40%、88.11%，與痰培養和抗酸染色檢測相比較，GeneXpert MTB/RIF 檢測利福平耐藥的效能更優，見表3。

表3 三種檢測方法與絕對濃度法藥敏試驗結果比較

3 討論

涂陰性肺結核具有較高的患病率和耐藥率，若不采取有效措施，則會嚴重威脅公共衛生安全，故對涂陰性肺結核予以及時的診斷和耐藥性的早期發現則顯得尤為重要。抗酸染色涂片法和痰培養是臨床上常用的結核病診斷方法，其中涂片法操作快速、簡單，但敏感度較低，且對標本的菌量要求較高，具有一定的局限性；而痰培養耗時較長，增加了延誤疾病診斷和治療的風險[4]。

GeneXpert MTB/RIF 檢測是近年來一種新型的檢測方法，能在2h 內直接從痰液標本中檢出是否含有結核分枝桿菌及該菌是否對利福平耐藥。該檢測方法主要通過巢式實時熒光定量PCR 法對結核分枝桿菌特有的序列rpoB 基因上與利福平耐藥相關的核心區域（RRDR）進行檢測，整合并自動進行樣品純化、核酸擴增、單一或復雜樣品中的目標序列測定[5，6]。本研究結果顯示，與痰培養和抗酸染色法相比，GeneXpert MTB/RIF 檢測涂陰性肺結核陽性率明顯較高。表明采用GeneXpert MTB/RIF檢測在提高涂陰性肺結核診斷率、減少漏診風險方面具有積極意義。此外，雖然涂陰性肺結核的傳播性較弱，但是仍有約13%的結核病傳播是由涂陰性肺結核造成的，故有效提高涂陰性肺結核患者陽性診斷率在結核病的早期診斷和防治工作中具有十分重要的意義[7，8]。此外，本研究結果還顯示，以臨床最終診斷為“金標準”，與痰培養、抗酸染色相比，GeneXpert MTB/RIF 檢測涂陰性肺結核的敏感度、特異性、準確度均較高，且與臨床最終診斷的一致性最高，提示GeneXpert MTB/RIF 檢測對涂陰性肺結核的診斷效能較高。分析原因可能是因為抗酸染色涂片檢測受操作方法等因素的影響，加之痰涂片的檢出率和痰液標本的性狀密切相關，需要每毫升痰液中至少有5000 拷貝抗酸桿菌才能檢出陽性，故出現陽性檢出率高低不一的情況較多[9，10]。痰培養耗時較長，一般至少需要6～8周，且可能有部分患者在診斷為涂陰性肺結核前服用過相關治療藥物，導致培養結果為陰性[11]。而GeneXpert MTB/RIF 檢測則具有更高的敏感度和特異性，且在2h 內即可得到檢測結果，因此與痰培養、抗酸染色相比，GeneXpert MTB/RIF 檢測在涂陰性肺結核中具有更優的診斷效能和臨床應用價值，可更好地對涂陰性肺結核患者進行輔助診斷。

利福平是目前臨床上治療肺結核的一線藥物，但耐藥性已成為肺結核傳播控制不理想的主要原因[12]。耐藥肺結核治愈率低、治療費用高且時間較長，已成為結核病防治工作中的重點難題[13]。本研究結果顯示，以絕對濃度法藥敏試驗結果為“金標準”，與痰培養和抗酸染色檢測相比，GeneXpert MTB/RIF 檢測利福平耐藥的效能更優，與鐘莉等[14]的研究相比，敏感度略低，考慮原因可能是不同地區菌株流行情況有所不同，利福平耐藥中的rpoB基因突變比例存在一定的差異。值得注意的是，GeneXpert MTB/RIF 雖僅能對利福平進行檢測，但有研究顯示大部分對利福平耐藥的肺結核患者對異煙肼也耐藥。GeneXpert MTB/RIF 在利福平耐藥的早期檢測中具有積極意義，同時也可作為耐藥肺結核的診斷方式[15]。

綜上所述，GeneXpert MTB/RIF 檢測涂陰性肺結核的敏感度、特異性、準確度均較高，具有良好的診斷效能，同時在篩查利福平耐藥方面也具有較高的臨床應用價值，值得推廣和應用。