免疫細胞及細胞因子在結核性腦膜炎發病機制中的作用

李蓉 魏亞軒 尹榕 葛朝明

結核性腦膜炎（Tuberculous meningitis，TBM）是由結核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）引起的一種嚴重中樞神經系統感染性疾病。結核病每年影響全球約1 000 萬人，其中2%～5%患有TBM。TBM 中有超過一半的患者預后不良，發生死亡或有神經后遺癥[1]。免疫系統被認為是TBM 預后不良的原因:一方面是對MTB 殺滅不徹底，另一方面是過度炎癥導致組織損傷[2]。MTB 感染機體后，多種免疫細胞及細胞因子參與免疫應答并相互作用，包括巨噬細胞、中性粒細胞等介導的先天性免疫反應，CD4+T 和CD8+T 等介導的適應性免疫反應，小膠質細胞、神經元等大腦宿主細胞對MTB的免疫反應以及腫瘤壞死因子α（TNF-α）和干擾素（IFN-γ）等細胞因子和趨化因子驅動的宿主炎癥反應[3]。近幾年，相關研究對于上述免疫細胞、細胞因子及趨化因子在TBM 發病機制中的作用有了更多認識。現就一些免疫細胞及細胞因子在TBM發病機制中的作用進行闡述。

1 先天性免疫應答

1.1 巨噬細胞巨噬細胞是MTB 生長的首選環境。機體被MTB 感染后，來自細菌抗原和輔助T 細胞炎癥細胞因子中的TNF-α 和IFN-γ 刺激誘導了巨噬細胞的激活[4]。TBM 中，MTB 通過受感染的免疫細胞，如巨噬細胞和中性粒細胞進入大腦（“特洛伊木馬”機制），與大腦內皮細胞結合，穿透血腦屏障，導致大腦中常駐免疫細胞被激活[5]。另外，活化的巨噬細胞對肉芽腫的形成至關重要。主要受宿主精細調控，巨噬細胞分化為M1 型和M2 型。M1型促進促炎反應，將先天性和適應性免疫應答相結合，是防御炎癥反應的關鍵；而M2 型促進抗炎反應，防止慢性炎癥狀態的加重，同時促進組織穩態的維持。兩者相互作用，調節肉芽腫的形成[4]。

1.2 樹突狀細胞（DC）DC 作為專業的抗原提呈細胞，在啟動免疫應答中發揮重要作用，也是連接先天性免疫和適應性免疫的橋梁。DC 存在兩個亞群，即髓系樹突狀細胞（mDCs）和漿細胞樣樹突狀細胞（pDCs）。mDCs 主要參與抗原攝取、T 細胞活化和IL-12 分泌，而pDCs 與IFN-γ 的產生相關，抗原呈遞作用有限。DC 和巨噬細胞主要負責蛋白水解過程和抗原呈遞，其功能包括:調節整體免疫反應，啟動抗原呈遞細胞活化，刺激T 淋巴細胞，激活自然殺傷（NK）細胞，增加IFN-γ 的產生，以及刺激抗原誘導細胞毒性[4]。Rao 等[6]研究發現，MTB 感染似乎與較低頻率的pDCs 有關。而在人類免疫缺陷病毒（HIV）相關TBM 患者中，pDCs 越少，臨床表現越嚴重。

1.3 中性粒細胞在TBM 中，中性粒細胞浸潤至大腦，執行吞噬、脫顆粒和中性粒細胞胞外誘捕網凋零（Neutrophil extracellular traposis，NETosis）的抗菌功能。中性粒細胞也介導中樞神經系統炎癥、組織破壞和免疫病理。中性粒細胞釋放的多種介質具有重要作用，包括:基質金屬蛋白酶（Matrix metalloproteinase，MMPs）可降解腦細胞外基質（Extracellular matrix，ECM），TNF-α 驅動炎癥，而驅動細胞壞死的活性氧（Reactive oxygen species，ROS）和中性粒細胞胞外誘捕網（Neutrophil extracellular traps，NETs）與血小板相互作用形成血栓，可能導致缺血性卒中。中性粒細胞抗菌庫如NETs、絲氨酸蛋白酶、MMPs 和ROS 是TBM 先天性免疫反應的一部分。中性粒細胞也與其他免疫細胞，如單核細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞和T 淋巴細胞等多方向相互作用，連接先天性免疫反應和適應性免疫反應，在遏制MTB 感染過程中發揮重要作用[7]。研究發現，中性粒細胞在TBM 免疫發病機制中發揮著重要作用，缺乏或過量對TBM 可能均有害[8]。Thuong 等[9]在越南TBM 臨床試驗中發現HIV 陽性個體腦脊液中平均中性粒細胞百分比和細胞因子的整體表達較HIV 陰性個體更高。Marais 等[10]及Thuong 等[11]縱向分析了南非與HIV 相關TBM血液和腦脊液樣本，發現中性粒細胞依賴性的炎癥激活信號可以在結核病治療開始前于外周血中檢測到，因此可能預測免疫炎癥重建綜合征（Immune reconstitution inflammatory syndrome，IRIS）。上述兩個研究結果表明，中性粒細胞在HIV 相關TBM 免疫發病機制中發揮了重要作用。

1.4 NK 細胞NK 細胞作為先天淋巴細胞，可在MTB 感染初始階段發揮細胞毒性，殺死細胞外MTB，有產生細胞因子的活性，可觸發巨噬細胞效應機制[12，13]。Laarhoven 等[13]證明NK 細胞是TBM患者腦脊液中富集的主要淋巴樣細胞之一。另一項研究表明，NK 細胞只有在MTB 感染活躍期才會被激活并進入組織[14]。目前，NK 細胞在TBM 中的相關研究較少，且作用不同，具體機制仍不明確。

2 適應性免疫應答

細胞免疫在控制胞內MTB 感染過程中起重要作用。細胞介導的免疫機制，包括Th1 型CD4+T 細胞、CD8+T 細胞、γδT細胞、CD1 限制性和HLA-E限制性T 細胞，都已被證明具有殺死巨噬細胞內MTB 的能力。體液免疫，特別是針對MTB 細胞壁成分的分泌型IgA，也可能有助于阻斷MTB 與上皮細胞和巨噬細胞的結合，從而參與對MTB 的保護性免疫應答[15]。對不同時間點TBM 兒童血液轉錄組分析表明，T 細胞增殖和免疫反應減少與疾病進展相關[16]。

3 大腦中宿主細胞

3.1 小膠質細胞小膠質細胞是中樞神經系統MTB感染的主要靶點。作為對抗腦內MTB 感染的第一道屏障，其很可能是疾病嚴重程度和臨床預后的關鍵決定因素。在病原體被識別后，MTB 在小膠質細胞內被內化和復制[5]。同時，小膠質細胞還通過多種抗菌機制破壞MTB，包括細胞因子介導的機制、抗菌肽、炎癥小體、ROS 和將抗原呈遞給CD4+T 淋巴細胞用于啟動適應性免疫[17]。一旦MTB 穿透中樞神經系統屏障，小膠質細胞被激活，釋放多種細胞因子。這些細胞因子在啟動、協調和調節結核免疫反應中有重要作用，不僅介導炎癥，而且破壞血腦屏障，允許先天性和適應性免疫細胞從外周流入中樞神經系統，導致腦損傷[4]。Zhou 等[17]研究發現，CD11b 抗體偶聯的可降解聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA）納米顆粒可作為一種有效的miR-124-3p 特異性傳遞給小膠質細胞，miR-124-3p 可通過抑制STAT3 信號通路誘導感染的小膠質細胞凋亡，從而控制MTB 增殖。該發現為開發新的TBM 治療策略提供了依據。

3.2 星形膠質細胞星形膠質細胞是中樞神經系統中最豐富的大膠質細胞，是血腦屏障的重要組成部分。它們通過結構、營養和代謝等方式支持神經元活動，在調節神經能量學和穩態功能方面起著關鍵作用[5]。有研究發現，神經元的凋亡和星形膠質細胞的存活可能在TBM 的進展中發揮潛在作用[18]。Mason[19]也提出了星形膠質細胞-小膠質細胞乳酸穿梭（AMLS）假說，即星形膠質細胞通過糖酵解產生高水平的乳酸，這些乳酸通過穿梭系統運輸到細胞外空間，并指向小膠質細胞。小膠質細胞吸收乳酸，將其轉化為丙酮酸，并立即在三羧酸循環和氧化磷酸化途徑中利用它來產生ATP 和自由基以對抗MTB。

3.3 神經元神經元通過先天免疫途徑被激活，在巨噬細胞中表達、結合和識別由細胞表面分子所介導，包括Fc 受體、甘露糖受體、補體受體和toll 樣受體（TLRs）[20]。其中，TLR2 和TLR4 對MTB 的保護性免疫功能至關重要[5]。Randall 等[20]首次觀察到神經元可被MTB 感染，并通過分泌IL-1β、IL-6和IL-10 進行免疫應答促進炎癥狀態。兒童TBM轉錄組學研究顯示，與腰椎腦脊液相比，腦室腦脊液有神經元興奮性毒性和腦損傷相關的顯著富集，存在神經元損傷的相關信號，上述過程主要由谷氨酸釋放和NMDA 結合及受體攝取驅動[21]。神經元在MTB 感染后發生免疫應答的機制目前仍不明確，還需要進一步研究來證明。

為進一步了解TBM 的發病機制，未來還需要更詳細地研究小膠質細胞、星形膠質細胞和神經元的具體作用及其各自產生的炎癥介質，以及對血腦屏障和血腦脊液屏障的影響。

4 細胞因子和趨化因子

細胞因子和趨化因子在MTB 感染后的免疫反應中發揮了重要作用。促炎細胞因子和抗炎細胞因子的不平衡影響了TBM 的嚴重程度和病程[8]。在TBM 發病機制研究中，已探討了多種細胞因子和趨化因子，如TNF-α、IFN-γ、IL-6、IL-8、IL-10、IL-18、IL-23、單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1）、γ-干擾素誘導蛋白-10（IP-10）、S100B 蛋白、MMP-2 和MMP-9 等[22]，近幾年研究較多的主要有以下幾種。

4.1 TNF-αTNF-α 主要由巨噬細胞和單核細胞產生，由依賴于TLR-2、TLR-4 和主要組織相容性復合體（MHC）Ⅱ類分子啟動。在宿主對MTB 的反應過程中發揮著微妙的平衡作用，可以防止不受控制的MTB 復制。然而，如果濃度過高，可能會導致過度炎癥狀態，出現嚴重的組織損傷和多種臨床癥狀[4，23]。Kumar 等[24]在兔TBM 實驗模型中發現，TNF-α 的促炎作用可以促進巨噬細胞活化，調節肉芽腫形成。當TNF-α 水平過高時，巨噬細胞可能聚集肉芽腫性炎癥，從而導致組織破壞、蛋白質水平增加和葡萄糖水平降低。印度的一項研究發現，與對照組相比，TBM 患者的TNF-α、IFN-γ和IL-6 水平均顯著升高，而在確診的TBM 和可能的TBM 亞組分析中，確診的TBM 中TNF-α 水平顯著升高[25]。Bhasin 等[26]研究發現，發生腦梗死TBM 患者較未發生腦梗死TBM 患者TNF-α 水平明顯升高，其次是IL-6。當只分析腦脊液生物標志物時，TNF-α 和IL-6 與腦卒中的發生密切相關，TNF-α、IL-6 是TBM 后腦卒中最有效的預測因子。這是因為TNF-α 介導的炎癥反應引起血管炎，并且TNF-α 和IL-1、IL-6 促進內皮損傷，形成動脈內膜炎。內皮細胞和毛細血管對這種壞死性效應的誘導特別敏感。Sharma 等[27]研究發現，HIV 相關TBM 患者腦脊液中TNF-α 水平與疾病的嚴重程度有關。Kalita 等[28]研究發現，TNF-α基因的表達可以預測TBM 患者退熱時間。另外，有多項研究表明TNF-α 抑制劑沙利度胺可能改善患者對抗生素治療的反應，尤其是在傳統的高劑量皮質類固醇治療不能控制慢性炎癥以及出現TBM相關神經系統并發癥的情況下[29，30]。調節有助于免疫的細胞因子是支持宿主防御或控制TBM 中過度有害炎癥的潛在策略。TNF-α 抑制劑可以限制TNF-α 過量引起的免疫病理，是一種很有前景的宿主定向治療方法，尤其是在皮質類固醇激素治療失敗的難治性TBM 中[23]。關于TNF-α 抑制劑（沙利度胺）、抗TNF-α 單克隆抗體（英夫利昔單抗、阿達木單抗）和可溶性TNF-α 受體（依那西普）在TBM 治療中的作用還需要更多的實驗研究來證實。

4.2 IFN-γIFN-γ 主要由激活的CD4+T、CD8+T細胞和NK 細胞產生。IFN-γ 在免疫介導抑制MTB 感染中發揮重要作用。首先，IFN-γ 作為巨噬細胞激活因子（MAF），誘導釋放過氧化氫（H2O2），介導抗菌作用；其次，IFN-γ 作為免疫調節劑，主要通過抑制CD4+T 細胞介導的IL-17 生成來限制中性粒細胞募集和組織炎癥[31]。目前實驗研究表明，IFN-γ 的升高可能是抗TBM 宿主防御的關鍵，而IFN-γ 的極度升高可能導致血腦屏障破壞和疾病傳播[4]。Thuong 等[9]研究發現，IFN-γ 的升高與TBM 的嚴重程度呈正相關。研究認為腦脊液IFN-γ 水平可作為診斷TBM 的一種手段，但假陽性率較高[8]。Bhasin 等[26]比較卒中和非卒中TBM之間的生物標志物時發現在沒有腦血管意外或血管異常的患者中IFN-γ 水平顯著高于其他患者。

4.3 IL-1IL-1 由星形膠質細胞、小膠質細胞以及受損的血腦屏障產生，該細胞因子增加了血腦屏障的通透性[32]。其家族成員包括IL-1α 和IL-1β，兩者均通過IL-1 受體Ⅰ型（IL-1R Ⅰ）與輔助蛋白作用，并與 IL-1R 拮抗劑（IL-1Rα）競爭性結合[33]。IL-1α 可以誘導IL-2 分泌，在對抗TBM 免疫反應中起重要作用。此外，IL-1α 與TNF-α 協同作用會導致肉芽腫性炎癥。IL-1β 是一種宿主抵御MTB 感染的重要促炎因子。實驗研究表明，全身給予IL-1β 可導致小膠質細胞激活，加重中樞神經系統炎癥和脫髓鞘改變，并且這種作用在受損和完全恢復的血腦屏障中均存在[34]。Sharma 等[27]研究發現，HIV 相關TBM 患者腦脊液中IL-1β 水平與疾病的嚴重程度有關。Koeken 等[35]研究發現，在未感染HIV 的TBM 患者中，腦脊液中IL-1β 水平升高，但與死亡率無關。在sst1 易感（Sst1S）基因型背景下，B6.Sst1S 同源小鼠出現了廣泛MTB 感染圖像，IL-1 表達增加[36]。上述研究表明，IL-1 信號通路可能在TBM 進展過程中具有重要作用，尤其是IL-1β與TBM 的免疫病理有關，可能是宿主定向治療的一個潛在靶點，下一步還需要更多的研究來證實。

4.4 IL-12IL-12 是由IL-12A（p35）和IL-12B（p40）兩種亞基編碼形成的異源二聚體，由抗原提呈細胞與MTB 相互作用后產生。而IL-12p40 在MTB 感染中的作用更為重要[37]。IL-12 在促進細胞介導的抗微生物病原體免疫過程中發揮著重要作用，是NK 細胞和Th1 細胞釋放IFN-γ 的關鍵細胞因子。一項關于兒童TBM 患者腦脊液中細胞因子的研究發現，由IL-12p40 促進的局部Th1 反應，表現為IP-10 和MCP-1 濃度升高，可能促進了結核瘤形成。而趨化因子TNF-α、重組人巨噬細胞炎癥蛋白-1α（MIP-1α）、IL-6 和IL-8 升高可能引起彌漫性細胞浸潤和炎癥，導致更廣泛的梗死[38]。在一項疑似TBM 患者腦脊液中細胞因子和趨化因子水平的診斷價值研究中發現IL-12p40 水平升高可作為診斷TBM 的輔助手段[37]。

4.5 IL-17IL-17 主要由Th1、Th17 和Th22 細胞分泌，可被IL-23 誘導。IL-17 通過誘導中性粒細胞招募，促進自身免疫性疾病的炎癥病理，保護宿主免受多種病原體影響的作用已得到證實。此外，IL-17 可觸發下游細胞因子如IL-6 和IL-8 的產生[39]。雖然IL-17 與MTB 感染密切相關，但MTB可能會減少IL-17 的分泌。有研究表明，HIV 相關TBM 患者腦脊液中IL-17 水平低于HIV 相關隱球菌腦膜炎患者[40]。

4.6 IL-6在MTB 感染后，IL-6 以TLR2 依賴的方式在DC 中產生。研究表明，IL-6 和IL-10 的共表達與信號轉導和STAT3 的構成性磷酸化有關，持續激活STAT3 的高表達表明T 細胞應答在結核病中受損[41]。Bhasin 等[26]在TBM 的研究中發現，出現癥狀時的腦脊液IL-6 濃度與疾病的嚴重程度獨立相關。另一項研究顯示，腦脊液和血清中各種細胞因子的濃度與TBM 的嚴重程度和影像學變化存在差異，TBM 嚴重程度分期與血清IL-6 不相關，但與腦脊液IL-6 相關[27]。

4.7 其他

4.7.1 MMPs MMPs 是一個鋅依賴的內肽酶家族，在降解細胞外基質大分子中起重要作用。MMPs 參與TBM 的發病機制，MMP-2 和MMP-9 可降解Ⅳ型膠原蛋白和層粘連蛋白等，并在血腦屏障破壞和腦組織損傷中發揮重要作用[42]。

4.7.2 血管內皮生長因子（VEGF） VEGF 是一種有效的內皮生長因子，在血管生成中發揮多種作用，具有血管毒性，促血栓形成，減少腦血流量，產生一氧化氮和無氧自由基等作用。在TBM 中，VEGF 與腦水腫和血腦屏障破壞有關[42]。

5 小結

TBM 的發病機制至今仍不明確，但通過大量研究，尤其是近年來興起的當代分子生物學“組學”技術在臨床樣本中的應用，研究者更清楚地掌握了TBM 患者腦脊液和血清樣本中的細胞因子譜，發現一些免疫細胞及細胞因子參與了TBM 的免疫應答，更好地認識了MTB 感染引起的免疫反應機制。探索免疫細胞、細胞因子和趨化因子在TBM 中的作用是了解其發病機制的關鍵步驟。結合多項實驗結果發現，免疫細胞和細胞因子在TBM 發病中的作用是復雜的、多面的，過量或缺乏都可能對機體有害，并且各種免疫細胞、趨化因子及細胞因子之間相互作用。目前TBM 的治療中，皮質類固醇激素及阿司匹林的有效性已被廣泛認可，雖然其具體的作用機制還不清楚，但免疫治療很可能是治療腦膜炎的一種策略。如研究較多的沙利度胺，是一種TNF-α 抑制劑，已有多項研究探究其治療TBM 的作用及預后[23，24，29，30]，但藥物的致畸性和T 細胞激活功能限制了其臨床使用[24，30]，如何利用治療的有效性而又避免或減少治療期間對機體的副作用，有針對性及靶向性地殺死MTB 是我們下一步研究的重點。同時還需要探究更多的免疫細胞及細胞因子作用機制，以利于開發有效的抗結核藥物，指導靶向免疫治療以及疫苗的研制。