大鼠腰椎間盤突出中交感神經分支作用的研究

李慶偉 齊豹 高龍飛

腰痛是臨床常見癥狀，50%～80%的人患有腰痛，15%的人可能患有慢性腰痛[1]。因腰痛就診的患者例數僅次于上呼吸道感染[2]。關于腰痛的發病機制尚未達成共識，最常見的原因是腰椎間盤退行性病變，這是一個復雜的生理過程，受環境、年齡、遺傳、動力學和其他許多因素的影響[3～5]。近年來，一些學者提出了一種新的椎間盤源性腰痛的概念，用于描述由于腰椎間盤內部成分及結構的病理性變化而引起的腰痛[6]。約40%的慢性腰痛患者患有椎間盤源性腰痛[7]。

目前，臨床對于椎間盤源性腰痛的發病機制認識不足。在患有椎間盤源性腰痛的患者中，椎間盤的纖維環通常伴有病理間隙。由于各種炎癥介質的作用，椎間盤的結構在上述生長和修復過程中會發生病理變化，從而導致腰痛[8，9]。Peng 等[10]的磁共振成像研究顯示，椎間盤源性腰痛患者的腰椎間盤高信號區基本均為纖維環裂隙內的炎性肉芽組織。交感神經在上述傳導途徑中起重要作用[11]。椎間盤后部的纖維環內以交感神經和脊神經為主，疼痛信息由交感神經介導[12]。因此，研究椎間盤源性腰痛的傳導途徑具有重要意義。

目前大多數關于椎間盤源性腰痛的研究主要集中在動物模型的交感神經干上。然而，交感神經干離斷對動物的腹部臟器和下肢功能有著較大影響[13]。因此在本研究中，使用熒光金（FG）逆行追蹤，采用物質P（SP）進行免疫組織化學（IHC）實驗來研究其機制，實驗中最大程度保護大鼠的神經功能。本實驗在分離L5～6椎間盤的L2和L5交感神經分支后，研究疼痛信息的傳導途徑，以此研究椎間盤源性腰痛的發病機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物選擇120 只體重為260～320g 的純種近交SD 大鼠，飼養在通風良好、室內濕度為51%～56%、溫度為20℃～25℃的清潔環境中，大鼠可以自由獲取食物和水。本研究經醫院倫理委員會批準。

1.2 分組和準備將120 只SD 大鼠分為椎間盤前部組（A 組，n=60）和椎間盤后部組（B 組，n=60）,A 組為椎間盤前部藥物注射并切斷不同交感神經；B 組為椎間盤后部藥物注射并切斷不同交感神經。再根據交感神經分支切斷部位將A 組分為A0、A-L2、A-L5、A-L2-L5組，各15 只大鼠；將B 組分為B0、B-L2、B-L5、B-L2-L5組，各15 只大鼠。

以40mg/kg 的劑量給予大鼠腹膜內注射3%戊巴比妥，并在麻醉后將其四肢固定至仰臥位，無菌條件下切開腹部，切口直徑約5cm，縱向切開腹膜使其橫向分離，并完全暴露交感神經干與其交通分支相交的部位。A0 組和B0 組不切斷椎間盤的交感神經分支，A-L2組切斷椎間盤前部的L2交感神經分支，A-L5組切斷椎間盤前部的L5交感神經分支，A-L2-L5組同時切斷椎間盤前部的L2和L5交感神經分支。同樣，B-L2組切斷椎間盤后部的L2交感神經分支，B-L5組切斷椎間盤后部的L5交感神經分支，B-L2-L5組同時切斷椎間盤后部的L2和L5交感神經分支。

1.3 FG 注射和治療處理將FG（購自奧特沃生物技術有限公司）注射到大鼠L5～6椎間盤的前后部。首先仔細處理L5～6椎間盤連通分支，縫合切口，然后將大鼠置于俯臥位。在大鼠背部行以L5～6椎間隙為中心的5cm 縱向切口。剝離椎旁肌，取出L5和L6椎板的上邊界，露出內鞘，將內鞘移出對側中線。然后使用含有0.2μl 的10%FG 注射器在纖維環處穿刺至1mm 深度，在10min 內緩慢注射溶液，并用氰基丙烯酸酯粘合劑封閉針孔以避免FG漏出。在FG 已注射至椎間盤后，用手術線縫合切口。手術后4 天內給予大鼠注射青霉素預防感染，劑量為2 000 000U/ml。手術后7 天對大鼠實施安樂死。移除T13～L6區段的前后背側神經節（DRG），并且移除L5～6椎間盤軟組織。固定DRG 和椎間盤軟組織，并將其浸入蔗糖-PBS（20%）溶液中過夜。

1.4 免疫組化分析將DRG 洗滌包埋，制成40μm厚的長軸位DRG 切片。切片放于0.1%Triton X-100 溶液中孵育20min。將切片在1:50 稀釋的兔抗大鼠SP 血清（由中國上海Abcam Trading Co.，Ltd 提供）中孵育72h。然后將切片在1:100 稀釋的山羊抗兔二抗中孵育60min。之后用PBS 洗滌樣品并固定在載玻片上。最后蓋上載玻片密封。

1.5 篩選和細胞計數處理好的L5～6椎間盤使用XSP-63X 三目熒光顯微鏡觀察FG 在注射部位周圍的滲透。在椎間盤周圍組織中觀察到FG 從纖維環中滲出，并擴散到髓核的中央區域。熒光顯微鏡檢查顯示FG 陽性細胞有金黃色細胞質，SP 陽性細胞有鮮紅色細胞質。在相同位置研究多個載玻片并計數FG 和SP 雙標記陽性的細胞數。

1.6 統計學方法采用SPSS 22.0 軟件進行統計學分析。計量資料以均數±標準差（±s）表示，組內比較采用t檢驗，組間比較采用單因素方差分析。計數資料以n（%）表示，采用χ2檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠一般情況比較A-L2組2 只大鼠FG注射失敗，符合率為86.67%（13/15）。A-L5組1只大鼠FG 注射失敗，符合率為93.33%（14/15）；A-L2-L5組4 只大鼠FG 注射失敗，符合率為73.33%（11/15）。B-L2組和B-L5組各2 只大鼠FG 注射失敗，符合率均為86.67%（13/15）。B-L2-L5組3 只大鼠FG 注射失敗，符合率為80.00%（12/15）。各組大鼠性別、周齡及體質量比較，差異無統計學意義（P＞0.05），見表1。

表1 各組大鼠一般情況比較[n（%）]

2.2 A 組大鼠椎間盤各部位DRG 細胞數量比較在大鼠L5～6椎間盤L2和L5交感神經分支離斷前后，A-L2組和A-L2-L5組L2區段中帶有雙標記的DRG 細胞數量顯著少于A0 組（t=5.173，P＜0.001；t=5.293，P＜0.001）。在其他區段中，不同組之間帶有雙標記的DRG 細胞數量差異無統計學意義（P＞0.05）。A-L2組和A-L2-L5組中，L2區段及其他區段中帶有雙標記的DRG 細胞數量差異無統計學意義（P＞0.05）。在A-L5組與A0 組中，T13、L1、L2、L3、L4、L5及L6區段內帶有雙標記的DRG 細胞數量差異無統計學意義（P＞0.05），見表2。

表2 A 組大鼠L5～6 椎間盤中L2 和/或L5 交感神經分支切斷前后帶有雙標記的DRG 細胞數量（±s）

表2 A 組大鼠L5～6 椎間盤中L2 和/或L5 交感神經分支切斷前后帶有雙標記的DRG 細胞數量（±s）

注：與A0 組比較，*P＜0.01

組別nT13L1L2L3L4L5L6 A0 組154.1±2.814.8±4.819.4±4.16.4±2.55.4±3.12.8±1.24.3±1.8 A-L2 組134.2±2.014.5±3.911.8±3.6*5.9±2.85.2±3.22.5±1.34.1±2.0 A-L5 組143.8±2.413.9±5.118.9±5.16.3±3.04.8±2.52.9±0.93.5±2.3 A-L2-L5 組 113.5±1.912.4±4.210.7±4.6*5.8±3.14.5±2.13.0±1.43.7±1.9 F 0.2210.65914.2500.1400.2650.4040.460 P 0.8800.581＜0.0010.9350.8490.7500.711

2.3 B 組大鼠椎間盤各部位DRG 細胞數量比較在大鼠L5～6椎間盤L2和L5交感神經分支離斷前后，與B0 組相比，B-L2組在L2區段中具有明顯更少的帶有雙標記的DRG 細胞數量（t=5.561，P＜0.001），B-L5組在T13、L1和L2區段中具有明顯更少的帶有雙標記的DRG 細胞數量（t=2.425，P=0.022；t=2.902，P=0.007；t=4.720，P＜0.001），B-L2-L5組在T13、L1和L2區段中具有明顯更少的帶有雙標記的DRG 細胞數量（t=3.472，P=0.001；t=4.613，P＜0.001；t=10.150，P＜0.001）。在其他區段中，不同組別之間帶有雙標記的DRG 細胞數量差異無統計學意義（P＞0.05）。B-L2-L5組L2區段中帶有雙標記的DRG 細胞數量明顯少于B-L2組和B-L5組（t=4.627，P＜0.001；t=5.229，P＜0.001）。在B-L2組和B-L5組中，T13、L1、L2、L3、L4、L5及L6區段帶有雙標記的DRG 細胞數量差異無統計學意義（P＞0.05），見表3。

表3 B 組大鼠L5～6 椎間盤中L2 和/或L5 交感神經分支切斷前后帶有雙標記的DRG 細胞數量（±s）

表3 B 組大鼠L5～6 椎間盤中L2 和/或L5 交感神經分支切斷前后帶有雙標記的DRG 細胞數量（±s）

注：與B0 組比較，*P＜0.01；與B-L2 組和B-L5 組比較，#P＜0.01

組別nT13L1L2L3L4L5L6 B0 組158.3±3.415.8±5.119.4±4.612.6±3.811.2±2.7 8.9±3.4 4.2±2.7 B-L2 組137.8±2.813.7±4.510.7±3.5*11.4±4.89.3±5.47.8±3.1 3.8±2.5 B-L5 組135.3±3.1*10.8±3.8*11.8±3.8*11.7±5.110.3±3.8 9.0±4.6 4.1±3.2 B-L2-L5 組124.4±2.1*8.5±3.4*5.3±2.1*#8.9±4.29.9±3.47.7±3.4 3.6±1.4 F 6.2597.40033.9001.6010.5800.4700.151 P 0.001＜0.001＜0.0010.2010.6300.7040.928

3 討論

下背部疼痛主要是由于椎間盤內部結構的變化所致。腰椎間盤纖維環的外層中含有大量纖維，且分布在整個外周纖維環中[9]。其有兩種類型的疼痛傳遞纖維：有髓鞘的Aδ 纖維和無髓鞘的C纖維[14]。椎間盤在纖維環破裂或損傷后會發生炎癥反應，這些反應可能涉及多種炎癥介質和炎癥細胞。由于椎間盤髓核中的內部疼痛感受器和纖維環周圍組織中神經末梢的刺激，觸發了不同程度的下背部疼痛[15，16]。正常椎間盤中的SP 免疫陽性神經纖維可存在于纖維環外層，但在退行性病變的髓核和椎間盤中，也能觀察到SP 免疫陽性的疼痛神經纖維[17]。機械或化學物質刺激傷害感受器或疼痛感受器可引發腰痛[18]。發生病理變化的腰椎間盤疼痛信息是由腰椎竇椎神經至相應的DRG 傳導的，其中相應的神經元節段占主導作用[19]。然而，椎間盤源性腰痛并不是沿著其周圍組織的主導區域分布，而是表現為彌散性背痛，固定的壓痛點較少，難以定位[20]。腰部皮膚和下腰部受臀上皮神經支配，這些神經是L1～3段中皮神經的后分支。相反，沒有皮神經在S1和L5節段的后分支區域中分布。因此，腰椎間盤病變引起的腰痛只能用L1和L2段中引起疼痛來解釋，而不是S1和L5段的放射性疼痛[21]。生殖道神經是L2區段中DRG 的分支之一，主要傳遞來自腹股溝區域皮膚的疼痛信息。因此，很難解釋神經根神經節段區域的具體主導[22]。

本研究采用FG 逆行追蹤和SP 免疫組織化學相結合的方法，研究大鼠L5～6椎間盤的疼痛信息通路。FG 具有高靈敏度，可用于標記細胞質個數，是使用最廣泛的中性逆行示蹤劑。FG 不僅可以標記傳遞疼痛的細胞和神經纖維，還可以標記非疼痛細胞和纖維神經[23]。SP 是參與疼痛信息傳遞的神經肽。腰椎間盤中具有鮮紅色細胞質的SP 陽性細胞代表DRG 神經元[24]。將大鼠L5～6椎間盤中切斷L5交感神經分支后，在A-L5組和A0 組之間任何區段中帶有雙標記的DRG 細胞數量均無顯著差異。這表明L5交感神經分支不參與大鼠L5～6椎間盤的神經傳導通路。在大鼠L5～6椎間盤中切斷L2交感神經分支后，A-L2組和A-L2-L5組在L2區段中帶有雙標記的DRG 細胞數量明顯少于A0 組。A-L2組和A-L2-L5組在L2區段中帶有雙標記的DRG 細胞數量無顯著差異。此外，僅離斷L2交感神經分支與同時切斷L2和L5交感神經分支后的功能相似。在大鼠中，L5～6椎間盤中的疼痛信息傳導過程不涉及相同節段中的L5交感神經分支或DRG。在L5～6椎間盤中切斷L5交感神經分支后，與B0 組相比，B-L5組T13、L1和L2區段中帶有雙標記的DRG 細胞數量顯著減少。此外，兩組之間其他區段帶有雙標記的DRG 細胞數量無顯著差異。這表明椎間盤中的疼痛信息通過兩條不同的通路傳導到上下腰椎DRG。L5交感神經分支參與上腰椎DRG 的傳導通路，而與下腰椎DRG 的傳導通路無關。在L5～6椎間盤中切斷L2交感神經分支后，與B0 組相比，B-L2組中帶有雙標記的DRG 細胞數量僅在L2區段中顯著減少。同時切斷L2和L5交感神經分支，B-L2-L5組L2區段中帶有雙標記的DRG 細胞數量顯著少于B-L2組和B-L5組。這表明L2和L5交感神經分支均參與并影響從L5～6椎間盤到L2DRG 疼痛信息的傳導，L2和L5交感神經分支在大鼠L5～6椎間盤的神經傳導通路中起到了不同作用。Suseki 等[25]報道了腰椎間盤中存在交感神經纖維和受體神經纖維的分布。腰椎間盤中的感覺神經沿竇椎神經進入交感神經分支，但不進入脊神經的同一節段。因此，L2和L5交感神經分支在大鼠L5～6椎間盤的疼痛信息傳導通路中起到了不同作用。

本研究中動物實驗具有可重復性，不同組別大鼠的性別、年齡及體質量無差異，確保了本研究的可靠性。但本研究仍存在一些不足之處：首先，在刺穿大鼠椎間盤時難以評估注射器刺入的深度，這可能導致同一區段中帶有雙標記的DRG 細胞數量的差異。其次，疼痛神經傳導途徑在大鼠和人之間不同，本研究并未揭示人類椎間盤源性腰痛的過程。再者，本實驗使用正常大鼠進行研究，因此無法研究可能發生在椎間盤源性腰痛發生發展過程中的特定機制。因此，在未來的研究中，應在具有病理性椎間盤源性腰痛患者中研究疼痛感知傳導途徑，以進一步驗證本研究的結論。

總之，L2和L5交感神經分支在大鼠L5～6椎間盤前部的疼痛信息傳導中起到了不同的作用。L2交感神經分支參與從L5～6椎間盤到L2DRG 的疼痛信息通路過程，而L5～6椎間盤的疼痛信息則通過兩條不同的通路傳導至上下腰椎DRG。L5交感神經分支參與從L5～6椎間盤向上腰椎的傳導通路過程，與L5～6椎間盤至下腰椎的傳導通路過程無關。