IL-17A三個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)與泉州地區(qū)人群類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎相關(guān)性研究

王清瑤 鄭晨娜 楊會(huì)勇 饒華春

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（Rheumatoid arthritis，RA）是一種以對(duì)稱性、破壞性關(guān)節(jié)病變?yōu)樘卣鞯穆匀硇宰陨砻庖咝约膊1]，在我國(guó)的發(fā)病率為0.32%～0.36%，在全球的發(fā)病率為0.5%～1.0%[2]。RA 因環(huán)境因素誘導(dǎo)或加劇病癥，患者關(guān)節(jié)多呈現(xiàn)對(duì)稱性、破壞性的病變。在相同的環(huán)境背景下，部分人群的RA 易感性顯著增強(qiáng)，這與個(gè)體RA 相關(guān)基因的單核苷酸多態(tài)性（Single nucleotide polymorphism，SNP）密切相關(guān)[3]。遺傳差異導(dǎo)致了個(gè)體差異及個(gè)體產(chǎn)生的免疫反應(yīng)不同，遺傳差異更好地解釋了不同個(gè)體疾病的易感性和流行病學(xué)的不同。

白介素-17（Interleukin-17，IL-17）是由Th17細(xì)胞分泌的一種致炎因子，能夠誘導(dǎo)多種炎癥因子和炎癥趨化因子的表達(dá)，在骨的侵蝕破壞過(guò)程中起重要作用[4]。IL-17A 基因位于第6 號(hào)染色體上，長(zhǎng)度4 252bp，其SNP 位點(diǎn)均位于非編碼區(qū)，其中人類非同義SNP 有9 個(gè)。IL-17A/F 基因多態(tài)性與多種炎癥反應(yīng)和自身免疫性疾病相關(guān)[5]。因此，本研究根據(jù) rs3819024A/G、rs3819025G/A 和rs4711998A/G 基因多態(tài)性分析，統(tǒng)計(jì)泉州地區(qū)人群的遺傳學(xué)數(shù)據(jù)，以便深入探討泉州地區(qū)人群RA 的發(fā)病特征、機(jī)制、基因遺傳背景和分子生物學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 一般資料本研究采用病例-對(duì)照研究法。207 例患者為泉州市正骨醫(yī)院已確診的RA 患者，達(dá)到ACR2010 RA 分類標(biāo)準(zhǔn)[6]。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他自身免疫性疾病、腫瘤、感染性疾病者；有嚴(yán)重肝病或腎功能障礙或心功能不全者；孕婦及哺乳期者；使用生物制劑、非甾體抗炎藥、糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑或中藥治療者。252 名健康對(duì)照者為體檢的健康志愿者，無(wú)遺傳疾病和傳染性疾病。本研究通過(guò)泉州市正骨醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有受試者均知情同意。

1.2 方法

1.2.1 外周血采集 采集研究對(duì)象外周血于EDTA抗凝管中，隨后分裝保存于-20℃冰箱。

1.2.2 引物設(shè)計(jì) 從NCBI 網(wǎng)站（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）獲取SNP 位點(diǎn)附近序列各250bp 左右。使用Primer 5.0 軟件設(shè)計(jì)一條正向公共引物和2 條分別與SNP 位點(diǎn)互補(bǔ)的特異性反向引物，其中3′端第三個(gè)堿基人為引入一個(gè)錯(cuò)配堿基[7]。

1.2.3 全血三引物擴(kuò)增法[8]采用本課題組建立的三引物等位基因特異性PCR 擴(kuò)增法進(jìn)行目的基因的SNP 分型檢測(cè)。15μl 擴(kuò)增體系如下：0.2μl 5U/μl Taq DNA 聚合酶（TaKaRa，大連），2μl 2.5mM dNTP，通用引物和特異性引物各0.5μl，1.5μl 10×Buffer（含Mg2+），2μl 50% 甘油，3μl 5דYW”緩沖液（本實(shí)驗(yàn)室自行研制），最后加入無(wú)菌水4.9μl。體系震蕩混勻，離心后靜止垂直加入外周血模板0.4μl。PCR 循環(huán)參數(shù)：96℃預(yù)變性3min；95℃變性20s，55℃復(fù)性20s，72℃延伸20s，循環(huán)35 次；72℃延伸5min，4℃保存。擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，取產(chǎn)物5μl 加入2%的瓊脂糖凝膠孔（ExRed 核酸染料染色），100V 電泳15min。紫外線凝膠成像系統(tǒng)顯像，根據(jù)條帶的位置和數(shù)目進(jìn)行基因型分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 25.0 統(tǒng)計(jì)軟件，等位基因及基因型頻率用基因計(jì)數(shù)法統(tǒng)計(jì)?；蛐偷腍ardy-Weinberg 平衡符合程度采用χ2檢驗(yàn)。組間基因型和等位基因頻率采用χ2檢驗(yàn)或Fisher 精確概率法，非條件Logistic 回歸模型分析不同基因型與RA發(fā)生的關(guān)系，計(jì)算比值比（oddsratio，OR）及其95%可信區(qū)間（95%CI），以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 研究對(duì)象特征分析及SNP 位點(diǎn)Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)252 名健康對(duì)照者中女108 例（42.86%），男144 例（57.14%）；年齡10～88 歲，平均（47.1±10.4）歲；隨機(jī)抽取門診或住院的屬于福建泉州地區(qū)漢族RA 患者207 例，年齡15～78 歲，平均（55.23±11.28）歲；其中女151 例（72.91%），男56 例（27.09%）。兩組患者性別、年齡比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且RA 患者中女性所占比例遠(yuǎn)大于男性，與國(guó)內(nèi)RA流行病學(xué)調(diào)查相符合。兩組3 個(gè)SNP 位點(diǎn)的分布頻率Hardy-Weinberg 平衡檢驗(yàn)均P＞0.05，符合隨機(jī)性抽樣原則，具有較好的群體代表性（見(jiàn)表1）。

表1 Hardy-Weinberg 檢測(cè)結(jié)果（P 值）

2.2 基因型和等位基因頻率分布比較rs3819024位點(diǎn)的AA、AG、GG 基因型在兩組的分布頻率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.683），等位基因A 型和G 型在兩組間患病風(fēng)險(xiǎn)比較，其OR值為1.078，95%CI為0.831～1.399，P=0.570。

rs3819025 位點(diǎn)的AA、GA、GG 基因型在兩組的分布頻率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.090）；與攜帶GG 純合基因型的研究對(duì)象相比，攜帶GA 或者AA+GA 基因型者患RA 風(fēng)險(xiǎn)較高。等位基因A 型和G 型在兩組間患病風(fēng)險(xiǎn)比較，其OR值為1.437，95%CI為1.014～1.037，P=0.041。

rs4711998 位點(diǎn)的AA、AG、GG 基因型在兩組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.713），等位基因A 型和G 型在兩組間患病風(fēng)險(xiǎn)比較，其OR值為0.926，95%CI為0.690～1.242，P=0.608。見(jiàn)表2。

表2 兩組基因型和等位基因頻率分布比較

3 討論

RA 是一種慢性、關(guān)節(jié)對(duì)稱受累的炎癥性自身免疫性疾病，表現(xiàn)為關(guān)節(jié)內(nèi)滑膜增生、骨和軟骨不可逆損傷[9]。在RA 發(fā)病發(fā)展的炎癥信號(hào)通路中，IL-17 因子可以促進(jìn)血管生成、骨損傷和加速自身免疫性進(jìn)程[10]。研究表明，克隆小鼠IL-17A 的cDNA序列激活后，分泌蛋白于胞外，導(dǎo)致NF-κB 和PB-激酶途徑激活，繼而誘導(dǎo)溶液纖維細(xì)胞分泌IL-6、IL-8 因子，進(jìn)一步刺激T 細(xì)胞增殖[11]。

近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)IL-17A 基因上的多個(gè)SNP位點(diǎn)與哮喘、RA、炎癥性腸炎和潰瘍性結(jié)腸炎等多種免疫性疾病顯著相關(guān)[12～17]。為此本研究根據(jù)文獻(xiàn)資料分析IL-17A 基因上3 個(gè)SNP 位點(diǎn)（rs3819024 A/G、rs3819025G/A 和rs4711998A/G）[18～25]與泉州地區(qū)人群RA 患病風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中rs3819025 A等位基因會(huì)增加RA 患病風(fēng)險(xiǎn)。

Chen 等[26]選取615 例RA 患者和839 名健康對(duì)照者為研究對(duì)象，研究IL-17A（rs3819024A/G、rs3819025G/A 和rs4711998A/G）基因多態(tài)性在當(dāng)?shù)厝巳褐信cRA 易感性的關(guān)聯(lián)，結(jié)果顯示rs3819025位點(diǎn)的A 等位基因會(huì)增加RA 患病風(fēng)險(xiǎn)（GA vs.GG：OR=1.29 [95%CI（1.02～1.63），P=0.036]；GG vs.AA+GA：OR=1.29 [95%CI（1.02～1.61），P=0.030]，與本研究結(jié)果一致。通過(guò)基因統(tǒng)計(jì)分析得出，IL-17A rs3819025G/A基因多態(tài)性與福建泉州地區(qū)RA 人群的易感性有一定關(guān)聯(lián)，其中攜帶AA 基因的人群可能屬于發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)較高人群?；蚨鄳B(tài)性SNP 作為人群、地域的一種分子標(biāo)志[27]，是遺傳變異中常見(jiàn)的一種，除了與種族、地域相關(guān)外，還與生活環(huán)境、飲食、生活方式、氣候等因素相關(guān)[28]。近年來(lái)，隨著基因測(cè)序等技術(shù)的快速發(fā)展，發(fā)現(xiàn)不同的遺傳背景導(dǎo)致群體疾病易感性、預(yù)后質(zhì)量和藥物反應(yīng)不同。因此研究IL-17A（rs3819024A/G、rs3819025G/A 和rs4711998A/G）基因多態(tài)性，不僅為RA 的相關(guān)發(fā)病機(jī)制研究以及防治提供科學(xué)有效的途徑，還為群體遺傳學(xué)和人類學(xué)的研究提供理論基礎(chǔ)[29]。同時(shí)，本研究也存在不足，一是樣本量較少，二是未與臨床生化指標(biāo)相聯(lián)系，三是未與其他地區(qū)人群進(jìn)行分析比較，結(jié)果僅具有區(qū)域代表性，如何深入分析IL-17A 基因多態(tài)性在不同民族、種族人群中對(duì)疾病的影響，是今后研究的方向。