糞便SDC2和TFPI2基因甲基化聯(lián)合檢測(cè)對(duì)結(jié)直腸癌及癌前病變的診斷效能分析

伍紅英 方慧祺 鄧燕 何水珍

結(jié)直腸癌是一種來源于大腸上皮的癌癥，為臨床常見的消化道惡性腫瘤之一，其發(fā)病機(jī)制尚不明確，可能為飲食、環(huán)境、生活方式、遺傳、化學(xué)致癌物質(zhì)及寄生蟲等多種因素共同作用的結(jié)果[1]。2020年我國(guó)癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，結(jié)直腸癌發(fā)病率居全部惡性腫瘤第2 位，死亡率位居第5 位，且大部分結(jié)直腸癌被確診時(shí)已為中晚期，預(yù)后較差，死亡率較高[2]。癌及癌前病變的早期篩查是防治癌癥、降低癌癥發(fā)生率和死亡率的重要環(huán)節(jié)，60%～80%的結(jié)直腸癌是由“腺瘤-癌”途徑發(fā)展而來，早期篩查、及早干預(yù)可將患者存活率提高至75%～90%[3]。結(jié)直腸鏡為結(jié)直腸癌早期篩查的常用方法之一，也是結(jié)直腸癌診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”，然而其為侵入性操作，具有出血、腸穿孔、感染等風(fēng)險(xiǎn)，且存在一定的漏檢率，而其他常見篩查方法如糞便潛血試驗(yàn)（Fecal occult blood test，F(xiàn)OBT）、血清學(xué)檢查、結(jié)直腸CT 等同樣存在敏感度、特異性不高，侵入性操作而導(dǎo)致患者依從性較差，易受食物、藥物的影響等缺陷，故在結(jié)直腸癌早期篩查和鑒別診斷中應(yīng)用受限[4]，因此，探尋適宜于普查的早期篩查手段，對(duì)于降低結(jié)直腸癌發(fā)病率和死亡率、提高其治愈率具有至關(guān)重要的意義。既往研究已證實(shí)，基因甲基化過程是一種伴隨眾多惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展的早期事件，在腫瘤篩查方面具有良好的應(yīng)用前景[5，6]。研究表明[7]，當(dāng)DNA 修復(fù)基因甲基化時(shí)可沉默抑癌基因的表達(dá)，抑癌基因突變與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，因此檢測(cè)相關(guān)基因的甲基化狀態(tài)可用于結(jié)直腸病變篩查。本研究通過檢測(cè)不同人群糞便中硫酸類肝素蛋白多糖（Syndecan 2，SDC2）和組織因子途徑抑制物2（Tissue factor pathway inhibitor 2，TFPI2）基因的甲基化狀態(tài)，探究其對(duì)結(jié)直腸癌及癌前病變的診斷效能，為臨床早期篩查、及早診治提供一定的幫助。

1 材料與方法

1.1 一般資料前瞻性納入2020年5月～2021年4月于我院消化內(nèi)科門診及住院就診的45 例結(jié)直腸病變患者作為研究對(duì)象，另納入同期于我院行體格檢查的健康者21 例作為對(duì)照組。所有受試者均在腸鏡檢查或手術(shù)前留取糞便樣本，保存于-80℃冰箱中。

經(jīng)結(jié)直腸鏡和術(shù)后病理學(xué)檢查，45 例結(jié)直腸病變患者中確診結(jié)直腸癌25 例，結(jié)直腸腺瘤20 例。結(jié)直腸癌診斷參考2020 版《中國(guó)結(jié)直腸癌診療規(guī)范》[8]中的相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)，并參照美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)（American Joint Committee on Cancer，AJCC）中的分期標(biāo)準(zhǔn)[9]，分為Ⅰ期4 例、Ⅱ期10 例、Ⅲ期7例和Ⅳ期4 例。結(jié)直腸癌組男17 例，女8 例，年齡36～72 歲，平均（52.61±5.18）歲；結(jié)直腸腺瘤組男10 例，女10 例，年齡34～70 歲，平均（52.23±5.54）歲；對(duì)照組男11 例，女10 例，年齡33～73 歲，平均（53.14±5.98）歲。三組受試者年齡、性別比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。所有受試者對(duì)本研究均知曉并簽署知情同意書。

1.2 納入及排除標(biāo)準(zhǔn)納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡25～75 歲；②除結(jié)直腸癌外無其他腫瘤；③入組前未接受過放化療；④收集糞便前5d 內(nèi)未行結(jié)腸鏡、灌腸、消化道鋇餐等診療操作；⑤依據(jù)Bristol 糞便分類法，收集糞便要求第1 型至第5 型，且量＞100g。

排除標(biāo)準(zhǔn)：①有結(jié)直腸手術(shù)既往史、結(jié)直腸腫瘤家族史者；②有潰瘍性結(jié)腸炎、克羅恩病等炎癥性腸病史者；③合并全身急慢性感染性疾病、精神疾病、其他嚴(yán)重器質(zhì)性病變者；④有腸鏡檢查禁忌證者；⑤妊娠或哺乳期女性。

1.3 方法本研究相關(guān)實(shí)驗(yàn)由廈門博創(chuàng)盛世生物技術(shù)有限公司、廈門艾德生物醫(yī)藥技術(shù)股份有限公司協(xié)助完成。

1.3.1 糞便DNA 提取 每例受試者取約0.2g 糞便，使用糞便基因組DNA 提取試劑盒（Solarbio 公司）提取總DNA，采用分光光度計(jì)對(duì)DNA 進(jìn)行純度檢測(cè)（A260/A280），選取檢測(cè)合格的DNA 置于-20℃冰箱保存，初檢不合格者再次進(jìn)行DNA 提取。

1.3.2 DNA 重亞硫酸鹽修飾和純化 使用重亞硫酸鹽DNA 甲基化試劑盒（QIAGEN 公司）進(jìn)行DNA重亞硫酸鹽修飾和純化，產(chǎn)物置于-20℃冰箱保存。

1.3.3 SDC2、TFPI2 基因甲基化特異性PCR（Methylation-specific PCR，MSP）反應(yīng) 取引物F 和R 各1μl，2μl DNA 模板，4μl dNTP，1μl Ex Taq，5μl 10xEx Taq E buffer，用ddH2O 補(bǔ)至50μl。PCR 擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性5min、95 ℃變性30s、60 ℃退火30s、72℃延伸30s，共循環(huán)35 次，再72℃延伸10min，4℃保存?zhèn)溆谩Ｒ镄蛄幸姳?。以3%瓊脂糖凝膠電泳分離擴(kuò)增產(chǎn)物，后進(jìn)行凝膠成像。圖像中M 代表甲基化特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，U 代表非甲基化引物特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，產(chǎn)物大小約100bp，Marker：天根公司DL2000 DNA Marker。檢測(cè)MSP 擴(kuò)增產(chǎn)物，如果用引物M 擴(kuò)增出片段，則說明檢測(cè)位點(diǎn)存在甲基化；若用引物U 擴(kuò)增出片段，則說明檢測(cè)位點(diǎn)不存在甲基化；若兩對(duì)引物均能得到陽性PCR 產(chǎn)物，則說明該片段部分甲基化。

表1 引物序列

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 20.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以n（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)。分別繪制SDC2 和TFPI2 基因甲基化單項(xiàng)檢測(cè)及聯(lián)合檢測(cè)對(duì)結(jié)直腸癌及結(jié)直腸腺瘤診斷的受試者工作特征（Receiver operating characteristic，ROC）曲線，判定各指標(biāo)的預(yù)測(cè)效能，以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1SDC2 基因甲基化檢測(cè)結(jié)果結(jié)直腸癌組與結(jié)直腸腺瘤組相比，SDC2 基因甲基化差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.103，P=0.748）；結(jié)直腸癌組與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=14.764，P＜0.001）；結(jié)直腸腺瘤組與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=15.251，P＜0.001），見圖1～3 及表2。

圖1 結(jié)直腸癌組糞便SDC2 基因甲基化狀態(tài)

圖2 結(jié)直腸腺瘤組糞便SDC2 基因甲基化狀態(tài)

圖3 對(duì)照組糞便SDC2 基因甲基化狀態(tài)

2.2 TFPI2 基因甲基化檢測(cè)結(jié)果結(jié)直腸癌組與結(jié)直腸腺瘤組比較，TFPI2 基因甲基化差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.640，P=0.423）；結(jié)直腸癌組與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=7.701，P=0.007）；結(jié)直腸腺瘤組與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=10.443，P=0.001），見圖4～6及表2。

圖4 結(jié)直腸癌組糞便TFPI2 基因甲基化狀態(tài)

圖5 結(jié)直腸腺瘤組糞便TFPI2 基因甲基化狀態(tài)

圖6 對(duì)照組糞便TFPI2 基因甲基化狀態(tài)

表2 各組SDC2 基因和TFPI2 基因甲基化檢測(cè)結(jié)果比較[n（%）]

2.3 SDC2 和TFPI2 基因甲基化對(duì)結(jié)直腸癌的診斷效能分別繪制SDC2 基因甲基化和TFPI2 基因甲基化單項(xiàng)檢測(cè)及聯(lián)合檢測(cè)對(duì)結(jié)直腸癌診斷的ROC曲線，見圖7。SDC2 基因甲基化對(duì)結(jié)直腸癌診斷的ROC 曲線下面積為0.744[95%CI（0.624～0.863）]，敏感度為71.61%，特異性為73.21%；TFPI2 基因甲基化對(duì)結(jié)直腸癌診斷的ROC 曲線下面積為0.751[95%CI（0.631～0.879）]，敏感度為73.71%，特異性為71.06%；SDC2 和TFPI2 基因甲基化聯(lián)合檢測(cè)對(duì)結(jié)直腸癌診斷的ROC 曲線下面積為0.913[95%CI（0.869～0.956）]，敏感度為81.37%，特異性為78.66%，高于各指標(biāo)單項(xiàng)檢測(cè)的預(yù)測(cè)效能。

圖7 SDC2 和TFPI2 基因甲基化單項(xiàng)和聯(lián)合檢測(cè)診斷結(jié)直腸癌的ROC 曲線

2.4 SDC2 和TFPI2 基因甲基化對(duì)結(jié)直腸腺瘤的診斷效能分別繪制SDC2 基因甲基化和TFPI2 基因甲基化單項(xiàng)檢測(cè)及聯(lián)合檢測(cè)診斷結(jié)直腸腺瘤的ROC曲線，見圖8。SDC2 基因甲基化診斷結(jié)直腸腺瘤的ROC 曲線下面積為0.713[95%CI（0.592～0.831）]，敏感度為66.31%，特異性為67.75%；TFPI2 基因甲基化診斷結(jié)直腸腺瘤的ROC 曲線下面積為0.721[95%CI（0.598～0.847）]，敏感度為59.89%，特異性為70.40%；SDC2 和TFPI2 基因甲基化聯(lián)合檢測(cè)診斷結(jié)直腸腺瘤的ROC 曲線下面積為0.878[95%CI（0.833～0.921）]，敏感度為73.38%，特異性為81.34%，高于各指標(biāo)單項(xiàng)檢測(cè)的預(yù)測(cè)效能。

圖8 SDC2 和TFPI2 基因甲基化單項(xiàng)和聯(lián)合檢測(cè)診斷結(jié)直腸腺瘤的ROC 曲線

3 討論

結(jié)直腸癌是一種大腸黏膜上皮由于飲食、環(huán)境、遺傳或生活方式等多種因素的作用而發(fā)生的惡性病變，是全球范圍內(nèi)第三大惡性腫瘤，在我國(guó)，隨著人們生活習(xí)慣和飲食結(jié)構(gòu)的改變，結(jié)直腸癌發(fā)病率和死亡率呈逐年上升趨勢(shì)[10]。結(jié)直腸癌進(jìn)展緩慢，大部分結(jié)直腸癌來源于腺瘤，由腺瘤發(fā)展至結(jié)直腸癌通常需3～10年時(shí)間[11]，若在此期間實(shí)現(xiàn)一級(jí)預(yù)防、二級(jí)定期篩查、三級(jí)治療，早期發(fā)現(xiàn)、及早干預(yù)，可顯著提高患者的生存率。然而，結(jié)直腸癌早期并無明顯臨床癥狀，僅約5%的患者可在早期確診，絕大多數(shù)患者確診時(shí)已為中晚期，預(yù)后較差、死亡率高[6]，因此，以切實(shí)有效的篩查方式提高早期檢出率是降低結(jié)直腸癌發(fā)病率和死亡率的關(guān)鍵。目前臨床診斷結(jié)直腸癌的方法主要有血清學(xué)指標(biāo)、結(jié)構(gòu)性檢查和基于糞便檢查等。血清學(xué)指標(biāo)包括血清癌胚抗原（Carcinoembryonic antigen，CEA）、糖類抗原19-9（Carbohydrate antigens 19-9，CA19-9）等，為臨床輔助診斷結(jié)直腸癌及判斷預(yù)后等常見指標(biāo)，然而由于其敏感度和特異性不高，對(duì)于早期病變?cè)\斷價(jià)值不大。結(jié)構(gòu)性檢查包括結(jié)直腸鏡、乙狀結(jié)腸鏡、CT 結(jié)腸成像、結(jié)腸氣鋇雙重造影等。結(jié)直腸鏡作為結(jié)直腸癌鑒別診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”，其結(jié)果準(zhǔn)確可靠，且可在檢查的同時(shí)切除病灶，具有診斷和治療的雙重價(jià)值，然而其同時(shí)存在侵入性和腸穿孔風(fēng)險(xiǎn)，患者依從性較差，難以廣泛用于早期普查；CT 結(jié)腸成像雖屬無創(chuàng)檢查，但敏感度與病灶大小有關(guān)，對(duì)于直徑＜1cm 的病灶敏感度較低，易漏檢，且存在輻射暴露風(fēng)險(xiǎn)；結(jié)腸氣鋇雙重造影需大量的腸道準(zhǔn)備工作，對(duì)腺瘤的敏感性較低，并且同樣存在輻射暴露風(fēng)險(xiǎn)，限制了其應(yīng)用。糞便檢查包括FOBT、糞便DNA 檢測(cè)等。FOBT 雖在我國(guó)已廣泛用于結(jié)直腸病變的早期篩查，然而其敏感度和特異性均不高，且易受食物、藥物等影響，導(dǎo)致結(jié)果不穩(wěn)定，此外，根據(jù)病變部位的不同，可能需要重復(fù)篩查或結(jié)合結(jié)直腸鏡進(jìn)一步診斷；糞便DNA 檢測(cè)的標(biāo)本前處理較為繁瑣，不適于大范圍人群的早期篩查[12]。因此，探尋與結(jié)直腸癌及癌前病變相關(guān)的高敏感度、高特異性的篩查方案成為目前亟待解決的難題。

近年來越來越多的研究證實(shí)，游離DNA 中某些特定基因的甲基化狀態(tài)為腫瘤發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中的早期事件之一，可作為肺腺癌、食管癌、結(jié)腸癌等癌癥及癌前病變?cè)缙诤Y查的重要生物學(xué)標(biāo)志物[13，14]。結(jié)直腸細(xì)胞增殖更新速度較快，而結(jié)直腸癌的黏膜脫落細(xì)胞較正常更多，因此分析糞便脫落癌細(xì)胞及特定游離DNA 的甲基化狀態(tài)可作為一種無創(chuàng)、高檢出率的結(jié)直腸病變潛在篩查手段。SDC2 屬于轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（Transforming growth factor-β，TGF-β）通路相關(guān)基因，為I 型跨膜硫酸肝素蛋白聚糖，參與細(xì)胞增殖、分化、遷移及免疫監(jiān)控等過程。SDC2 可由腫瘤細(xì)胞合成釋放，并通過相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。研究表明[15]，腫瘤組織中SDC2 基因啟動(dòng)子區(qū)域發(fā)生異常甲基化，其甲基化水平遠(yuǎn)高于相鄰非腫瘤組織，故SDC2 基因甲基化狀態(tài)可作為結(jié)直腸癌早期篩查的標(biāo)志物之一。在本研究中，結(jié)直腸癌組和結(jié)直腸腺瘤組患者SDC2 基因甲基化陽性水平均顯著高于對(duì)照組，提示SDC2 基因甲基化可能與結(jié)直腸病變過程有關(guān)。龔志贇等[16]研究亦顯示，結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中伴隨SDC2 基因甲基化的發(fā)生，糞便SDC2 基因甲基化檢測(cè)可作為一種安全、無創(chuàng)、高效的結(jié)直腸癌篩查手段，有助于準(zhǔn)確評(píng)估結(jié)直腸病變的進(jìn)展。在結(jié)直腸病變過程中，SDC2參與調(diào)節(jié)細(xì)胞與腫瘤微環(huán)境之間的相互作用，活化基質(zhì)金屬蛋白酶（Matrix metalloproteinase，MMP），分解細(xì)胞外基質(zhì)（Extracellular matrix，ECM），同時(shí)參與間質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)化（Epithelial-mesenchymal transition，EMT）等生物學(xué)進(jìn)程，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、分化和遷移，因而與結(jié)直腸癌及癌前病變關(guān)系密切。

TFPI2 基因是一種絲氨酸蛋白酶抑制劑，廣泛分布于人體各個(gè)組織器官中，定位于染色體7q22上，可抑制纖溶酶、胰蛋白酶等蛋白酶的活化，并直接參與調(diào)控ECM 的再建過程，對(duì)于細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整性至關(guān)重要。既往研究發(fā)現(xiàn)[17]，包括胃癌、食管癌、結(jié)直腸癌等在內(nèi)的多種惡性腫瘤患者體內(nèi)均存在TFPI2 基因異常甲基化的現(xiàn)象。李海軍等[18]研究顯示，在結(jié)直腸癌及進(jìn)展期腺瘤患者中TFPI2 基因甲基化的檢出率分別為88.6%、68.6%，顯著高于正常健康人群。本研究結(jié)果同樣顯示，結(jié)直腸癌組和結(jié)直腸腺瘤組患者TFPI2 基因甲基化陽性水平均顯著高于對(duì)照組，提示TFPI2 基因的甲基化可能與結(jié)直腸病變過程有關(guān)，糞便TFPI2 基因甲基化狀態(tài)可作為早期篩查結(jié)直腸癌及癌前病變的有效指標(biāo)之一。

本研究進(jìn)一步將SDC2 和TFPI2 基因甲基化納入ROC 曲線分析，結(jié)果顯示，SDC2 基因甲基化對(duì)結(jié)直腸癌和結(jié)直腸腺瘤診斷的ROC 曲線下面積分別為0.744[95%CI（0.624～0.863）]和0.713[95%CI（0.592～0.831）]，敏感度分為71.61%和66.31%，特異性分別為73.21%和67.75%，對(duì)結(jié)直腸腺瘤的診斷效果不甚理想。TFPI2 基因甲基化對(duì)結(jié)直腸癌和結(jié)直腸腺瘤診斷的ROC 曲線下面積分別為0.751[95%CI（0.631～0.879）]和0.721[95%CI（0.598～0.847）]，敏感度分為73.71%和59.89%，特異性分別為71.06%和70.40%，診斷效果仍不理想。臨床實(shí)踐證實(shí)，多指標(biāo)聯(lián)合檢測(cè)可相互補(bǔ)充，提高診斷效能。本研究進(jìn)一步將SDC2 和TFPI2 基因甲基化聯(lián)合檢測(cè)，結(jié)果顯示，SDC2 和TFPI2 基因甲基化聯(lián)合檢測(cè)對(duì)結(jié)直腸癌和結(jié)直腸腺瘤診斷的ROC 曲線下面積分別為0.913[95%CI（0.869～0.956）]和0.878[95%CI（0.833～0.921）]，敏感度分別為81.37%和73.38%，特異性分別為78.66%和81.34%，顯著高于SDC2 或TFPI2單項(xiàng)檢測(cè)，大大提高了對(duì)結(jié)直腸癌和結(jié)直腸腺瘤的診斷效能，有助于避免臨床出現(xiàn)誤診、漏診。

綜上所述，SDC2 和TFPI2 基因甲基化檢測(cè)為一種非侵入性的檢測(cè)手段，可作為臨床診斷結(jié)直腸癌和結(jié)直腸腺瘤的重要生物學(xué)指標(biāo)，且兩者聯(lián)合檢測(cè)的診斷效能更高，可為臨床早期篩查結(jié)直腸癌和癌前病變、及早干預(yù)、改善預(yù)后提供一定的幫助。