CircRNA087631在腦出血患者中的表達及與各臨床指標之間的關系

賈 琦，盛楠楠，胡玉奇，劉 祺

(石河子大學醫學院第一附屬醫院，新疆 石河子 832000)

出血性腦卒中在全球的死亡率、致殘率均占據較高水平，是全世界死亡和殘疾的主要原因，嚴重威脅著人民的健康水平[1-2]。2017年全球疾病負擔(GBD)數據顯示，腦卒中是造成我國減壽年數(YLL)的第一位病因[3]。據推測，2030 年我國腦血管病事件發生率將較 2010 年升高約 50%[4]。隨著社會的發展和醫療水平的不斷進步，腦出血的預后有所好轉，但仍不理想。腦出血的發生機制復雜，其中包括神經炎性反應、神經元細胞的凋亡等一系列病理生理反應，因此在腦出血后探索神經炎性因子的機制并進行適當干預，可有效提高腦出血的預后。

編碼和非編碼RNA的轉錄圖譜已被廣泛用于腦出血，以獲得對復雜疾病途徑的新見解，識別生物標志物以更好地診斷和預測準確性[5-6]。因此，對腦出血中這些RNA進行更全面的分析可能有助于建立有效的干預措施，以減輕腦損傷。腦出血后腦損傷的機制復雜多樣，主要涉及細胞毒性、興奮性毒性、氧化應激和炎性反應等，導致神經元、膠質細胞和血管內皮細胞等細胞凋亡或壞死以及存活和增殖，最終影響血腦屏障(BBB)的通透性和完整性[7-8]。血腦屏障功能障礙是腦出血后腦損傷的一個標志[9-10]。這種破壞將促進腦水腫的形成，通過促進白細胞的涌入參與神經炎性反應，并允許潛在的神經活性物質進入血腫周圍的大腦，所有這些都可能導致腦損傷。因此，尋找促進腦血管完整性的潛在靶點是治療腦出血的方法。

環狀RNA(CircRNAs)是新近發現的內源性非編碼RNA(NcRNAs)，CircRNAs是一組異質性的非編碼轉錄本，在頭部3'端和尾部5'端之間具有共價鍵，形成環狀模式，在中樞神經系統中高度保守并大量表達[11-12]。小腦中CircRim2、CircEl2和CircDym的豐富以及皮質中CircPlxnd1的高表達證明了這一點[13]。雖然它們的生理功能還沒有完全確定，但在發育中的突觸形成過程中，已經在大腦中觀察到了幾種CircRNAs的表達量變化。而CircRNA087631在出血性腦卒中的表達及作用尚未有研究，因此，本文旨在研究CircRNA087631在腦出血患者中的表達并分析預后及與腦出血之間的關系。

1 材料與方法

1.1納入對象：納入25例石河子大學醫學院第一附屬醫院2020年6月～2021年6月期間住院的腦出血患者，腦出血診斷標準按照1992年版《腦出血的診斷標準》。納入標準： CT影像學檢查確診腦出血患者。排除標準：①患有各類癌癥患者；②除外顱腦外傷、顱內占位或感染病變者；③除外腦梗死后繼發出血者；④有自身免疫性疾病或其他炎性患者；⑤除外近期服用抗凝藥物者。依據病史、檢查、檢驗結果將診斷為腦出血的患者納入試驗組，同期以門診健康體檢者25例作為對照組。本研究通過本院倫理委員會審批，均已簽署知情同意書。

1.2材料與方法：收集并分析年齡、體重指數(BMI，kg/m2)、缺乏鍛煉等一般基線資料。測定糖化血紅蛋白、同型半胱氨酸、白細胞、血紅蛋白、血小板、紅細胞和中性粒細胞計數等指標。

1.3實時熒光定量PCR：Trizol法提取肝臟組織中總RNA，調平后逆轉錄成cDNA，條件為：37℃ 2 min，42℃ 60 min，70℃ 5 min，4℃ 保存。將所得cDNA進行實時熒光定量PCR，所用PCR引物序列見表1。擴增條件為:95℃ 10 min，95℃ 15 s，60℃ 30 s，循環次數40次。使用2-△△Ct計算公式得出mRNA的表達量。

表1 PCR引物序列

2 結果

2.1一般資料比較： 此研究納入50例研究對象，其中腦出血組25例，正常對照組25例。在腦出血組中，BMI水平明顯高于正常對照組，差異有統計學意義(P<0.05)；并且具有腦卒中家族史的患者人數明顯多于正常對照組，差異有統計學意義(P<0.01)。見表2。

表2 組間一般資料比較

2.2組間生化指標比較：與正常對照組相比較，腦出血組中的糖化血紅蛋白水平升高，差異有統計學意義(P<0.05)；腦出血組的同型半胱氨酸水平高于正常對照組；腦出血組白細胞計數高于正常對照組；腦出血組的血小板計數低于對照組；差異均有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 組間生化指標之間比較

2.3CircRNA087631在出血性腦卒中的表達：通過對腦出血患者及健康體檢者的血液提取血液中總RNA后檢測CircRNA的表達發現，與對照組比較，試驗組均高表達CircRNA087631，差異具有統計學意義(P<0.05)。

2.4CircRNA087631的表達與臨床指標之間的關系：通過測定CircRNA的表達與50例患者的臨床指標進行分層，發現CircRNA的表達高低與BMI的升高、存在腦卒中家族史、糖化血紅蛋白的升高、同型半胱氨酸的升高、血小板的升高、發生腦出血有著密切關系。見表4。

表4 Circ RNA087631的表達與臨床指標的關系(n)

2.5CircRNA087631水平與腦卒中患者臨床特征相關性分析：Spearman 相關性分析顯示，CircRNA087631水平與腦卒中家族史、同型半胱氨酸、出血量、白細胞均呈正相關；與GCS評分呈負相關，差異有統計學意義(P<0.05)。見表5。

表5 CircRNA087631水平與結直腸癌腦卒中患者臨床特征相關性分析

3 討論

在出血性腦卒中，需要預后性生物標志物以了解腦出血的發展階段，從而可以制定個體化治療策略，鑒于此必須確定用于該疾病的廉價且方便的預后生物標志物。既往的研究并未對腦卒中家族史與腦出血的關系得出明確結論。應激性高血糖不利于神經元修復，進一步加重腦損害，腦出血發生時，59%的非糖尿病患者在入院時血糖水平升高，而45%的患者在入院后72 h內血糖水平一直保持升高(應激性高血糖與腦出血患者預后的關系分析)。同型半胱氨酸水平增高是導致腦出血的原因之一[14]。腦出血，血液滲入大腦，小膠質細胞增多并分泌炎性因子，直接干擾血腦屏障功能，加重 ICH 后的炎性反應[15]。GCS評分可以對腦出血患者的預后進行早期預測且評分越低，預后越差。血小板可作為重要的危險因素，對卒中后血栓復發和出血轉歸進行評價。隨著血小板計數水平的減少，出血風險進行性增加[16]。

本研究揭示了腦出血患者與未發生腦出血患者中相比CircRNA的差異性表達及對疾病進展的相關分析。在本文中首次顯示了CircRNA在腦出血中的差異性表達，并對CircRNA的表達與腦出血患者的預后相聯系。此外本研究表明腦出血后CircRNA表達水平的變化受到多種動態的調節，與體內多種生化指標變化相協調。

腦出血早期的腦活動主要以細胞死亡和局部炎性反應為主，同時伴有血腦屏障破壞并水腫的形成；對于慢性腦出血后炎性反應幾乎全部消失，血腦屏障修復起到了主導作用，包括但不限于神經發生、血管形成和緊密連接組裝。但是長期血腦屏障的修復會導致神經退變。因此對于急性或慢性腦出血的治療方案基本是靶向分子治療。血腦屏障的破壞在急慢性腦出血神經功能障礙的發生發展中起關鍵作用。對腦出血患者的基礎研究為其復雜的病理生理過程提供了方向，特別是揭示了炎性反應在推動神經元死亡和導致出血后屏障破壞的神經缺陷中的作用。

研究發現CircRNA在腦出血呈現出高表達，提示在腦出血的發展過程中發揮了重要的作用。通過收集腦出血患者基本資料及腦出血后生化指標的變化，發現多種指標的變化與CircRNA的變化相一致。Wang等人發現在235例蛛網膜下腔出血患者的血液中CircAFF1 上調，闡明了CircAFF1/miR-516b/SAV1/YAP1軸在血管內皮功能障礙中的作用及腦出血疾病的潛在早期診斷價值[17]。本文發現在腦出血患者中CircRNA-087631呈現出高表達，且通過對患者基本資料分析發現與正常對照組相比較，血中同型半胱氨酸呈現出高表達，且表達的高低與CircRNA的表達相一致。血同型半胱氨酸的表達高低與H型高血壓相關，有研究發現在H型高血壓患者血液中存在高表達的同型半胱氨酸，而腦出血的高危因素中就存在高血壓，高血壓性腦出血廣泛存在于腦出血的患者中；本文又對患者的基本資料進行對比，發現腦出血患者患有高血壓的概率為94%；因此猜想在腦出血的發病過程中CircRNA的激活表達紊亂，導致CircRNA087631表達升高，通過一系列通路的激活使血中同型半胱氨酸的表達升高引起H型高血壓導致腦出血。因此研究腦出血中CircRNA的表達對腦出血的治療及探究機制研究奠定基礎。

相關性分析顯示，CircRNA087631水平與腦卒中家族史、同型半胱氨酸、出血量、白細胞均呈正相關；與GCS評分呈負相關。Xie等[18]發現腦外傷后，損傷側海馬區CircRNA差異表達，認為CircRNA變化不僅與腦損傷有關，而且可能與外傷后的神經新生存在某些關系。研究發現初期腦出血導致血液中的谷氨酸進入組織間隙，出血后凝血酶的產生導致Src激酶活化，隨著同型半胱氨酸的升高，增加神經元受到興奮性毒性損傷的風險[19]。Cui等[19]發現腦出血21 d后腦組織中的lncRNA與mRNA呈差異性表達，認為線粒體基質、G蛋白耦聯受體活性降低及嗅覺傳導受損、炎性反應可能參與腦出血后功能障礙的形成過程調節。

本研究存在一定的局限性，如樣本數量小，因此本研究結果可能存在偏差，且部分患者由于死亡，從而缺少遠期影像學資料，因此在今后的研究中本課題組將增加樣本量，延長觀察時間。通過更多的亞組分型，探索出血部位、出血時間、出血影響因素與腦卒中的關系，進一步納入更多的CircRNA，明確其在出血性卒中中的作用以及是否會出現出血轉歸，是否可將CircRNA序列作為出血性腦卒中(特別是早期患者) 的常規篩查序列，精準尋找該疾病的高危因素，對患者進行相關預后評估。