蟾毒靈通過激活內質網應激通路誘導HCT116細胞凋亡

尚 靖，李宗恒，夏 琪，唐東豪，陳 佳，袁澤婷，殷佩浩1,

結直腸癌(colorectal cancer,CRC)是全球最普遍的一種惡性腫瘤，有調查顯示，2020年全球有 940 000 人死于CRC，死亡人數仍在增加[1]。在一定程度上，傳統的術后放療和化療能改善療效，但放療耐受和化療耐藥常常導致治療失敗。抗凋亡是大多數癌癥產生放療耐藥和化療耐藥的主要原因，因此促進腫瘤細胞凋亡是改善癌癥治療的關鍵目標之一[2]。

蟾毒靈是從中藥蟾酥中提取的中藥單體，研究[3-8]表明蟾毒靈具有廣泛的抗腫瘤作用，包括抑制細胞增殖、誘導腫瘤細胞凋亡，抑制腫瘤細胞的耐藥，防止侵襲和轉移。研究[9]指出，誘導細胞凋亡是蟾毒靈最重要的抗腫瘤方式之一。而持續的內質網應激(endoplasmic reticulum stress,ERS)與細胞凋亡密不可分[10]。因此該研究觀察蟾毒靈對結直腸癌HCT116細胞凋亡和增殖的作用，并探討ERS在HCT116細胞凋亡中的作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑RPMI-1640培養基、雙抗(青霉素-鏈霉素溶液)和胰酶購自美國Gibco公司；胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)購自以色列BI公司；蟾毒靈購自成都瑞芬思生物科技有限公司；4-苯基丁酸購自美國MedChemExpress公司；Cell Counting Kit-8(CCK-8)細胞增殖毒性檢測試劑盒和Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒購自日本DOJINDO公司；RIPA裂解液、苯甲基磺酰氟(fhenylmethanesulfonylfluoride，PMSF)、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液、BCA蛋白濃度測定試劑盒和SDS-PAGE電泳相關試劑購自上海碧云天生物技術有限公司；兔源B淋巴細胞瘤-2(B cell lymphoma-2，Bcl-2)抗體(ab32124)和鼠源β-actin抗體(ab6276)購自英國Abcam公司；兔源葡萄糖調節蛋白78(glucose regulated protein 78，GRP78)抗體(3177S)、兔源Bcl-2關聯X蛋白(Bcl-2-associated X protein，Bax)抗體(2772S)、兔源真核翻譯起始因子2α(eukaryotic translation initiation factor 2α，eIF2α)抗體(5324S)、兔源磷酸化真核翻譯起始因子2α(phosphorylated eukaryotic translation initiation factor 2α，p-eIF2α)抗體(3398S)和鼠源C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein，CHOP)抗體(2895P)購自美國Cell Signaling Technology公司；兔源磷酸化蛋白激酶R樣內質網激酶(phosphorylated protein kinase R like endoplasmic reticulum kinase，p-PERK)抗體(abs137056)購自愛必信(上海)生物科技有限公司；ECL顯影液和PVDF膜購自美國Miliipore公司。

1.2 細胞培養用含有1%雙抗和10% FBS的RPMI-1640培養基培養HCT116細胞，在5% CO2、37 ℃的培養箱中培養，取對數生長期細胞進行實驗。

1.3 CCK-8法檢測細胞活力取HCT116細胞接種至96孔板(1.5×104個/孔)。第2天用含不同濃度蟾毒靈(0、2.5、5、10、20、40 nmol/L)的培養基或含不同濃度4-苯基丁酸(0、1、2、4、8、16 mmol/L)的培養基替換原來的培養基，并孵育48 h，然后根據制造商的說明書加入CCK-8工作液，培養箱中孵育1h后，然后根據制造商的說明書用酶標儀檢測在450 nm處的吸光度，并計算細胞存活率。

1.4 AnnexinV/PI流式細胞術檢測細胞凋亡取HCT116細胞接種至6孔板(1×105個/孔)。待貼壁后棄去原有的培養基，用含有不同濃度蟾毒靈(0、2.5、5、10 nmol/L)的新鮮培養基孵育48 h。收集細胞至離心管，用PBS洗滌后，用1×Annexin V Binding Solution重懸，將細胞濃度調整至1×106個/ml。取100 μl細胞懸液至流式管，加入Annexin V-FITC和PI各5 μl，室溫下避光孵育15 min，加入500 μl PBS混勻后用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.5 Western blot檢測蛋白表達取HCT116細胞接種至6孔板(3×105個/孔)。待貼壁后棄去原有的培養基，根據實驗分組分別處理48 h后，用PBS洗3次后，加入RIPA裂解液(含PMSF)，在冰上裂解10 min，將裂解物轉移至EP管后，在4 ℃條件下12 000 r/min離心25 min，取上清液，用BCA法測定蛋白濃度，加入SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液后在金屬浴(100 ℃)中煮10 min；取15 μg細胞總蛋白進行SDS-PAGE電泳，結束后將其轉移至PVDF膜，并用5%脫脂牛奶封閉1 h，按目標蛋白的分子量裁剪PVDF膜，將目標條帶與對應的一抗孵育過夜(4 ℃)，一抗包括GRP78(1 ∶1 000)、Bax(1 ∶1 000)、eIF2α(1 ∶1 000)、p-eIF2α(1 ∶1 000)、CHOP(1 ∶1 000)、Bcl-2(1 ∶1 000)和β-actin(1 ∶5 000)；洗滌3次后與對應的二抗(兔二抗1 ∶2 000，鼠二抗1 ∶2 000)在常溫下孵育1h，洗膜3次后，用ECL顯影液進行顯色。

2 結果

2.1 蟾毒靈對HCT116細胞增殖活性的影響如圖1所示，不同濃度的蟾毒靈(0、2.5、5、10、20、40 nmol/L)作用HCT116細胞48 h之后，用CCK-8法檢測細胞增殖活性，蟾毒靈抑制了HCT116細胞的增殖活力，測得半數抑制濃度為(19.86±1.49) nmol/L，且隨蟾毒靈濃度增大，抑制作用逐漸增強，與0 nmol/L相比，差異有統計學意義(F=301.9，P<0.001)，同時確定選用10 nmol/L作為后續實驗的最大干預濃度。結果表明蟾毒靈抑制HCT116細胞的增殖活性。

圖1 蟾毒靈對HCT116細胞增殖的影響

2.2 蟾毒靈可以促進HCT116細胞凋亡將HCT116細胞用不同濃度的蟾毒靈(0、2.5、5、10 nmol/L)干預48 h后，用流式細胞術檢測細胞凋亡，結果如圖2所示，與對照組(0nmol/L蟾毒靈)相比，隨蟾毒靈濃度升高，HCT116細胞的細胞凋亡率依次升高(F=85.27，P<0.001)，提示蟾毒靈可以促進HCT116細胞凋亡。

2.3 蟾毒靈對HCT116細胞凋亡蛋白的影響為了進一步驗證蟾毒靈可以促進HCT116細胞的凋亡，將HCT116細胞用不同濃度的蟾毒靈(0、2.5、5、10 nmol/L)干預48 h后，用Western blot法檢測HCT116細胞內凋亡相關蛋白的變化，結果如圖3顯示，與對照組(0 nml/L蟾毒靈)相比，隨著蟾毒靈濃度增加，Bax蛋白相對表達量逐漸升高(F=8.062，P<0.01)，Bcl-2蛋白相對表達量逐漸下降(F=68.94，P<0.001)。以上數據表明，蟾毒靈可以提高Bax的水平，并使Bcl-2表達降低，從而誘導HCT116的凋亡。

圖2 蟾毒靈對HCT116細胞凋亡的影響

2.4 蟾毒靈對HCT116細胞ERS通路蛋白表達的影響為了進一步驗證蟾毒靈能否誘導HCT116細胞發生ERS，將HCT116細胞用不同濃度的蟾毒靈(0、2.5、5、10 nmol/L)干預48 h后，用Western blot法檢測ERS相關蛋白GRP78、p-PERK、eIF2α、p-eIF2α和CHOP的表達情況。結果如圖4所示，與對照組(0 nml/L蟾毒靈)相比，隨著蟾毒靈濃度增加，GRP78、p-PERK、p-eIF2α和CHOP蛋白相對表達量逐漸升高(FGRP78=26.18，Fp-PERK=42.35，Fp-eIF2α=23.83，FCHOP=132.9，P<0.001)，而eIF2α蛋白相對表達量逐漸下降(F=31.74，P<0.001)。表明蟾毒靈上調了GRP78蛋白的表達，說明蟾毒靈能誘導HCT116細胞ERS；同時，蟾毒靈對p-PERK、p-eIF2α和CHOP蛋白表達起到了上調作用，對eIF2α的蛋白表達起到下調作用，對PERK/eIF2α/CHOP信號通路起到激活作用。

圖3 蟾毒靈對Bax和Bcl-2蛋白表達的影響

2.5 蟾毒靈聯合ERS抑制劑對HCT116細胞凋亡蛋白的影響用ERS抑制劑4-苯基丁酸處理HCT116細胞48 h，選用非殺傷濃度2 mmol/L(圖5A)作為聯合用藥的濃度。設置對照組、蟾毒靈組(10 nmol/L蟾毒靈)和聯合組(10 nmol/L蟾毒靈+2 mmol/L 4-苯基丁酸)分別處理HCT116細胞48 h，隨后用Western blot對HCT116細胞中Bax和Bcl-2的變化進行檢測，圖5B和5C可以看出，蟾毒靈組Bax蛋白的相對蛋白表達量高于對照組，而在聯合4-苯基丁酸后，表達量下降(F=68.18，P<0.001)；蟾毒靈組Bcl-2蛋白的相對表達量低于對照組，而在聯合4-苯基丁酸后，表達量上升(F=47.82，P<0.001)。以上結果進一步驗證蟾毒靈可通過誘導ERS來促進細胞凋亡。

圖4 蟾毒靈對內質網應激相關蛋白表達的影響

3 討論

內質網在缺氧、營養缺乏、突變蛋白過多、藥物作用及氧化還原狀態的改變等不利條件下，蛋白質的折疊功能受損，錯誤折疊的蛋白質積累在內質網會觸發ERS，對此，細胞為了保持細胞內環境穩態而發生一系列反應，稱為未折疊蛋白反應(unfolded protein response,UPR)[11]。UPR三種主要的應力傳感器為三種跨膜蛋白(位于內質網中)，分別為蛋白激酶R樣內質網激酶(protein kinase R-like ER kinase, PERK)、肌醇需求酶1(inositol-requiring protein 1, IRE1)和激活轉錄因子6(activating transcription factor 6, ATF6)[12]。當內質網相對動態平衡時，應力傳感器在內質網管腔中的GRP78結合，使其處于滅活狀態；在ERS條件下，GRP78對錯誤折疊蛋白質中暴露的疏水多肽結構域具有更高的親和力，從而導致GRP78與三種跨膜蛋白解離，UPR信號通路被激活[11]。UPR的主要目的是恢復內質網的動態平衡，以確保細胞存活，而持續且嚴重的ERS會引起細胞凋亡[13]。例如，在ERS被激活時，PERK的磷酸化使多種PERK底物(其中包含eIF2α)磷酸化，進而阻斷了eIF2-GTP-Met-tRNA的形成，減少蛋白質翻譯，從而緩解內質網中的蛋白質折疊負擔[11, 14]。然而，如果ERS仍未緩解，持續的PERK激活將導致CHOP上調，增加促凋亡的Bcl-2家族蛋白的表達，以促進細胞凋亡[11, 15]。

圖5 蟾毒靈聯合4-苯基丁酸對Bax和Bcl-2蛋白表達的影響

本研究結果顯示，蟾毒靈可呈濃度依賴性地抑制HCT116細胞增殖活性；蟾毒靈可以誘導HCT116細胞凋亡，Western blot檢測結果顯示蟾毒靈可以下調Bcl-2并上調Bax表達，表明蟾毒靈能誘導HCT116細胞發生凋亡。為了確定蟾毒靈是否誘導了HCT116細胞的ERS，首先分析了ERS的標志蛋白GRP78的表達情況，結果顯示GRP78表達上調，表明蟾毒靈誘導了ERS；緊接著對于ERS通路PERK/eIF2α/CHOP上的蛋白的表達情況進行檢測，結果顯示在蟾毒靈的刺激下，p-PERK、p-eIF2α和CHOP表達會隨濃度上升而上升，而eIF2α表達會隨濃度上升而下降，說明蟾毒靈激活了該通路。為了探討ERS與HCT116細胞凋亡的關系，使用了4-苯基丁酸(ERS抑制劑)，聯合用藥組(蟾毒靈+4-苯基丁酸)與蟾毒靈組相比，Bcl-2的表達顯著上調，Bax的表達下調，表明在4-苯基丁酸抑制ERS之后，細胞凋亡也被抑制了，表明在蟾毒靈誘導HCT116細胞凋亡中，ERS起到了重要作用。

綜上所述，本研究證實，蟾毒靈能有效地抑制HCT116細胞增殖的活性，并能誘發HCT116的凋亡，而該作用在一定程度上是通過激活ERS來實現的。這說明蟾毒靈有可能成為一種直接靶向凋亡途徑來治療CRC的潛在藥物，并為蟾毒靈的臨床轉化提供了理論依據。