cAMP/Epac/Rap1信號(hào)通路調(diào)控NG2細(xì)胞分泌IL-1β、TNF-α、BDNF及酸棗仁皂苷A的作用研究

楊婷婷，王 慧，石 鵬，滕 柳，李 悅，杜 敏，涂小華，楊光勇，鄧 穎

NG2神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)實(shí)質(zhì)中表達(dá)神經(jīng)元膠質(zhì)細(xì)胞抗原2(neuron glial antigen 2，NG2)的非神經(jīng)元、非血管性神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。它能夠分泌白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)及腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)[1]，這些物質(zhì)能夠影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)中神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞的活性。環(huán)磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)作為胞內(nèi)第二信使，可通過PKA-cAMP反應(yīng)原件結(jié)合蛋白(cAMP response element binding，CREB)、cAMP直接激活的環(huán)磷酸腺苷結(jié)合蛋白(exchange proteins directly activated by cAMP，Epac)等信號(hào)通路，參與睡眠和晝夜節(jié)律、調(diào)控學(xué)習(xí)記憶等多種功能[2]。NG2細(xì)胞分泌IL-1β、TNF-α、BDNF是否與cAMP/Epac/Rap1信號(hào)通路有關(guān)，目前尚未見報(bào)道。

酸棗仁皂苷A(Jujuboside A，JuA)具有鎮(zhèn)靜催眠的作用。JuA是否通過作用于NG2細(xì)胞發(fā)揮作用，其機(jī)制尚不明確。該研究采用細(xì)胞培養(yǎng)的方法，觀察cAMP/Epac/Rap1信號(hào)通路參與調(diào)控NG2細(xì)胞分泌IL-1β、TNF-α、BDNF的過程，探討JuA對(duì)NG2細(xì)胞發(fā)揮的作用，揭示JuA的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株NG2細(xì)胞株購(gòu)于青旗(上海)生物技術(shù)發(fā)展有限公司，編號(hào)BFN60803943。

1.2 儀器與試劑MK3型酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo公司)；ABI7500型自動(dòng)實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time PCR)儀(美國(guó)ABI公司)；ChemicDocTMXRS+成像(美國(guó)Bio-Rad公司)。JuA(純度>98%，CAS號(hào)55466-04-1)購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；胎牛血清(批號(hào)04-001-1acs)、青霉素-鏈霉素溶液(批號(hào)03-031-1B)均購(gòu)自以色列BI公司；DMEM培養(yǎng)基(批號(hào)C11330500BT)購(gòu)自美國(guó)Gbico公司；CCK-8試劑盒(批號(hào)02-024-1ACS)購(gòu)自日本同仁化學(xué)研究所；提取細(xì)胞總RNA試劑盒(批號(hào)R6834-01)購(gòu)自廣州飛揚(yáng)生物工程有限公司；cDNA第一鏈合成預(yù)混試劑(批號(hào)A224-10，北京康潤(rùn)誠(chéng)業(yè)生物科技公司)；2×SuPer SYBR Green qPCR Master Mix試劑盒(批號(hào)QP002)購(gòu)自上海奕杉生物科技有限公司；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(批號(hào)P0010)購(gòu)自上海碧云天公司；兔多抗BDNF(批號(hào)bs-0248R)購(gòu)自美國(guó)Bioss公司；兔單抗IL-1β(批號(hào)#31202)、兔多抗TNF-α(批號(hào)8184s)均購(gòu)自美國(guó)CST公司；兔單抗cAMP(批號(hào)Ab76238)、兔單抗Epac(批號(hào)Ab109415)、兔多抗Rap1(批號(hào)Ab113480)均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；兔多抗GAPDH(批號(hào)AB-P-R 001)購(gòu)自杭州賢至生物有限公司。

1.3 NG2細(xì)胞鑒定課題組前期實(shí)驗(yàn)經(jīng)過免疫熒光檢測(cè)，鑒定該細(xì)胞株為NG2細(xì)胞[3]。

1.4 NG2細(xì)胞的培養(yǎng)與分組處理NG2細(xì)胞復(fù)蘇后，用含DMEM的完全培養(yǎng)基(10% FBS+1%青霉素-鏈霉素溶液)常規(guī)培養(yǎng)，置于5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中，每2 d換液1次，待細(xì)胞融合度至80%時(shí)傳代。將細(xì)胞分為對(duì)照組(完全培養(yǎng)基)、百日咳毒素(pertussis toxin，PTX)組(特異性增加細(xì)胞內(nèi)cAMP含量5 μmol/L+完全培養(yǎng)基)、ESI-09組(Epac特異性拮抗劑1.5 μmol/L+完全培養(yǎng)基)、JuA組(最佳濃度的JuA+完全培養(yǎng)基)、陽(yáng)性藥組(75 μmol/L艾司唑侖+完全培養(yǎng)基)。

1.5 CCK-8法檢測(cè)JuA對(duì)NG2細(xì)胞存活率的影響取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的NG2細(xì)胞，96孔板按每孔8×103個(gè)/100 μl接種，設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，置于5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中24 h。吸棄孔內(nèi)的完全培養(yǎng)基，向培養(yǎng)板中加入100 μl含不同濃度(5、10、20、40 μmol/L JuA)的完全培養(yǎng)基。孵育24 h后，向每孔加入10 μl CCK-8溶液，避光繼續(xù)孵育1 h。酶標(biāo)儀檢測(cè)各組450 nm處的吸光度(absorbance，A)，計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.6 RT-PCR法檢測(cè)IL-1β、TNF-α、BDNF、cAMP、Epac、Rap1 mRNA相對(duì)表達(dá)量取6孔板，按2×105個(gè)/孔接種細(xì)胞。按上述分組干預(yù)細(xì)胞。應(yīng)用NCBI中Primer-BLASTPCR設(shè)計(jì)引物，見表1。采用試劑盒提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄cDNA。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為內(nèi)參基因。反應(yīng)體系為：2×SYBR Green qPCR Mix 10 μl、ROX 0.4 μl、上游引物0.5 μl、下游引物0.5 μl、cDNA 1 μl、ddH2O 7.8 μl；反應(yīng)條件為：95 ℃ 5 min、95 ℃ 10 s、60 ℃ 1 min、95 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。采用2-△△Ct法對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

表1 基因引物序列

1.7 Western blot法檢測(cè)IL-1β、TNF-α、BDNF、cAMP、Epac、Rap1蛋白相對(duì)表達(dá)量取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的NG2細(xì)胞，按2×105個(gè)/孔接種至6孔板中。按1.4項(xiàng)分組干預(yù)細(xì)胞。按蛋白提取試劑盒提取各組NG2細(xì)胞蛋白，應(yīng)用BCA蛋白檢測(cè)試劑盒定量，電泳分離后，轉(zhuǎn)移至 PVDF 膜；經(jīng)封閉、一抗孵育(稀釋度均為1 ∶1 000)，TBST洗膜，HRP標(biāo)記二抗(1 ∶10 000)孵育，TBST洗膜后，應(yīng)用ChemicDocTMXRS+成像顯影，計(jì)算IL-1β、TNF-α、BDNF、cAMP、Epac、Rap1相對(duì)蛋白表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 JuA對(duì)NG2細(xì)胞存活率的影響為了檢測(cè)JuA對(duì)NG2細(xì)胞存活率的影響，本實(shí)驗(yàn)選取濃度為0～40 μmol/L JuA干預(yù)細(xì)胞。與0 μmol/L組比較，20、40 μmol/L JuA組細(xì)胞存活率降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)，JuA的濃度低于10 μmol/L時(shí)對(duì)NG2細(xì)胞存活率無明顯影響。見圖1。根據(jù)CCK-8法檢測(cè)結(jié)果，已知0～10 μmol/L JuA為安全濃度，因此，選取10 μmol/L JuA用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 JuA對(duì)NG2細(xì)胞24 h存活率的影響(n=6)

2.2 PTX對(duì)NG2細(xì)胞IL-1β、TNF-α、BDNF、cAMP mRNA表達(dá)的影響與對(duì)照組比較，PTX降低IL-1β、TNF-α mRNA的表達(dá)(P<0.01)，增加BDNF、cAMP mRNA的表達(dá)(P<0.01)。見圖2。

圖2 PTX對(duì)NG2細(xì)胞IL-1β、TNF-α、BDNF、cAMP mRNA表達(dá)的影響(n=6)

2.3 PTX對(duì)NG2細(xì)胞IL-1β、TNF-α、BDNF蛋白表達(dá)的影響與對(duì)照組比較，PTX降低IL-1β和TNF-α蛋白的表達(dá)(P<0.01)，增加BDNF蛋白的表達(dá)(P<0.01)。見圖3。

圖3 PTX對(duì)NG2細(xì)胞IL-1β、TNF-α、BDNF蛋白表達(dá)的影響(n=3)

2.4 ESI-09對(duì)NG2細(xì)胞IL-1β、TNF-α、BDNF、Epac、Rap1 mRNA表達(dá)的影響與對(duì)照組比較，ESI-09增加IL-1β、TNF-α mRNA的表達(dá)(P<0.05，P<0.01)，降低BDNF、Epac、Rap1 mRNA的表達(dá)(P<0.01)。見圖4。

圖4 ESI-09對(duì)NG2細(xì)胞IL-1β、TNF-α、BDNF、Epac、Rap1 mRNA表達(dá)的影響(n=6)

2.5 ESI-09對(duì)NG2細(xì)胞IL-1β、TNF-α、BDNF、Epac、Rap1蛋白表達(dá)的影響與對(duì)照組比較，ESI-09增加IL-1β和TNF-α蛋白表達(dá)(P<0.01)，降低BDNF、Epac和Rap1蛋白表達(dá)(P<0.01)，見圖5。

圖5 ESI-09對(duì)NG2細(xì)胞IL-1β、TNF-α、BDNF、Epac、Rap1蛋白表達(dá)的影響(n=3)

2.6 JuA對(duì)NG2細(xì)胞IL-1β、TNF-α、BDNF、cAMP、Epac、Rap1 mRNA表達(dá)的影響與對(duì)照組比較，JuA增加IL-1β、TNF-α、BDNF、cAMP、Epac和Rap1mRNA的表達(dá)(P<0.05，P<0.01)；陽(yáng)性藥增加BDNF、IL-1β、TNF-α、cAMP、Epac和Rap1 mRNA的表達(dá)(P<0.05，P<0.01)。見圖6。

圖6 JuA對(duì)NG2細(xì)胞IL-1β、TNF-α、BDNF、cAMP、Epac、Rap1 mRNA表達(dá)的影響(n=6)

2.7 JuA對(duì)NG2細(xì)胞IL-1β、TNF-α、BDNF、cAMP、Epac、Rap1蛋白表達(dá)的影響與對(duì)照組比較，JuA增加IL-1β、TNF-α、BDNF、cAMP、Epac和Rap1蛋白表達(dá)(P<0.01)；陽(yáng)性藥增加IL-1β、TNF-α、BDNF、cAMP、Epac和Rap1蛋白表達(dá)(P<0.01)。見圖7。

3 討論

NG2細(xì)胞作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)中一類新型神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，不僅能夠表達(dá)γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)、谷氨酸(glutamic acid，Glu)、5-羥色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)等神經(jīng)遞質(zhì)受體，還表達(dá)Na+、K+、Ga2+、Cl-等電壓門控性離子通道。Glu和GABA是腦內(nèi)興奮性和抑制性的神經(jīng)遞質(zhì)。課題組前期研究[4]顯示，NG2細(xì)胞的興奮性受到抑制后可影響大鼠中縫核內(nèi)Glu和GABA的含量。NG2細(xì)胞與Glu能和GABA能神經(jīng)元產(chǎn)生功能性突觸連接，并接受神經(jīng)元突觸信號(hào)輸入，對(duì)興奮性和抑制性信號(hào)作出反應(yīng)，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)信息傳遞和神經(jīng)元活動(dòng)的調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。NG2細(xì)胞能夠產(chǎn)生α氨基-3-羥基-5-甲基-4-異噁唑丙酸(α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole-propionicaci，AMPA)受體介導(dǎo)的突觸后興奮性電流，并以劑量依賴性方式抑制其增殖，這些效應(yīng)的發(fā)生是由神經(jīng)元引發(fā)的Glu信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)所調(diào)節(jié)的[5]。表明NG2細(xì)胞可能與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的興奮性有關(guān)。

在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，cAMP/Epac信號(hào)通路在細(xì)胞中普遍表達(dá)，不僅參與細(xì)胞正常的生理活動(dòng)，還參與中樞神經(jīng)軸突再生、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞黏附、睡眠調(diào)節(jié)等功能[6]。研究表明增加細(xì)胞內(nèi)cAMP可抑制TNF-α和IL-1β的釋放[7]，細(xì)胞以cAMP/Epac依賴性方式產(chǎn)生BDNF[8]。表明cAMP/Epac信號(hào)通路能夠介導(dǎo)細(xì)胞分泌IL-1β、TNF-α和BDNF。Rap1激活是由各種細(xì)胞外刺激誘導(dǎo)的，并且通過cAMP與Epac信號(hào)傳導(dǎo)密切相關(guān)。Rap1的激活也能抑制IL-1β、TNF-α細(xì)胞因子的產(chǎn)生[9]。cAMP/Epac/Rap1是否參與調(diào)控NG2細(xì)胞分泌IL-1β、TNF-α、BDNF值得進(jìn)一步研究。本研究使用特異性增加細(xì)胞內(nèi)cAMP含量的PTX，發(fā)現(xiàn)PTX可減少NG2細(xì)胞IL-1β、TNF-α mRNA和蛋白的表達(dá)，增加BDNF和cAMP mRNA和蛋白的表達(dá)。然而使用ESI-09后，IL-1β、TNF-α和BDNF mRNA和蛋白表達(dá)與PTX趨勢(shì)相反，Epac和Rap1 mRNA和蛋白表達(dá)降低。表明cAMP/Epac/Rap1信號(hào)通路參與NG2細(xì)胞分泌IL-1β、TNF-α和BDNF。

圖7 JuA對(duì)NG2細(xì)胞的影響(n=3)

JuA是酸棗仁中的一種關(guān)鍵皂苷，具有抗焦慮和鎮(zhèn)靜催眠作用，可降低睡眠潛伏期和延長(zhǎng)睡眠時(shí)間。現(xiàn)代研究[10]表明JuA不僅通過抑制Glu神經(jīng)元介導(dǎo)的興奮信號(hào)通路，提高GABA神經(jīng)元受體的基因轉(zhuǎn)錄水平，調(diào)節(jié)腸道黏膜系統(tǒng)上IL-1β、TNF-α等細(xì)胞因子的分泌，影響大腦神經(jīng)細(xì)胞之間的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)，還通過調(diào)節(jié)cAMP-PKA信號(hào)通路，發(fā)揮鎮(zhèn)靜和催眠作用。JuA如何對(duì)NG2細(xì)胞發(fā)揮作用目前尚未明確。本研究顯示JuA可增加NG2細(xì)胞IL-1β、TNF-α、BDNF、cAMP、Epac、Rap1 mRNA和蛋白的表達(dá)，而PTX增加cAMP和BDNFmRNA和蛋白的表達(dá)，降低IL-1β和TNF-α mRNA和蛋白的表達(dá)。這可能是由于JuA還通過其他信號(hào)通路影響NG2細(xì)胞分泌IL-1β和TNF-α。研究[11]顯示IL-1β、TNF-α可通過上調(diào)興奮性Glu能傳遞和下調(diào)抑制性GABA能傳遞來增加大腦興奮性。BDNF通過酪氨酸激酶受體B、N-甲基-D-天冬氨酸受體，改變細(xì)胞膜對(duì)Ca2+、Na+通透性起到調(diào)節(jié)神經(jīng)興奮性的作用[12]。提示IL-1β、TNF-α和BDNF能夠影響皮層興奮性。本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)JuA可能作用于cAMP/Epac/Rap1信號(hào)通路調(diào)控NG2細(xì)胞分泌BDNF，進(jìn)而影響皮層興奮性來發(fā)揮作用。

綜上所述，NG2細(xì)胞能通過cAMP/Epac/Rap1信號(hào)通路分泌IL-1β、TNF-α、BDNF，JuA可能通過影響NG2細(xì)胞的分泌功能及cAMP/Epac/Rap1信號(hào)通路來發(fā)揮作用。未來本課題組將繼續(xù)探討JuA影響NG2細(xì)胞分泌IL-1β和TNF-α有關(guān)的信號(hào)通路。