2-羥基-3-甲基蒽醌誘導結腸癌細胞凋亡機制的研究

陳小燕，吳應強，朱 蓉，趙 逵

結腸癌的發病率和死亡率較高、預后差[1-2]，臨床治療以手術、化學為主，但放化療的毒副作用較強。中醫學認為大腸癌以脾腎虧虛為本虛，以熱毒、瘀血、濕熱為標實[3]，臨床上常以清熱解毒、活血化瘀、消腫散結等中藥用于治療大腸癌[4]，其副作用較少。前期研究結果證實白花蛇舌草對結腸癌可抑制細胞生長和誘導細胞凋亡[5-6]，但對其內在成分分析和作用機制研究較少。2-羥基-3-甲基蒽醌(2-hydroxy-3-ethylanthraquinone, HMA)為白花蛇舌草中提取出的一種蒽醌類化合物，研究表明該化合物對白血病、肝癌、卵巢癌、乳腺癌、肺癌等多種腫瘤具有明顯增殖抑制作用及誘導凋亡作用[7-8]，但關于其抗腫瘤的機制，尤其在結腸癌研究較少。因此，該研究通過TCMSP等數據庫預測HMA調控的靶基因，體外細胞實驗研究HMA對結腸癌細胞株增殖和凋亡的影響并分析及可能的機制，為臨床研究提供一定的實驗室依據和理論基礎。

1 材料與方法

1.1 細胞人結腸癌細胞株HCT-116和HT-29購自中國科學院細胞庫。

1.2 主要試劑HMA(上海源葉生物科技有限公司)、胎牛血清(FBS)(美國Thermo Fisher Scientific公司)；McCoy′s 5A培養基(江蘇凱基生物有限公司)；青鏈霉素混合液和磷酸鹽緩沖液(美國Hyclone公司)；Caspase-9、Caspase-3、Bax、Bcl-2一抗，羊抗兔二抗(美國CST 公司)；CCK-8試劑盒和Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒(武漢Abbkine公司)；RIPA裂解液、PMSF、封閉液、ECL顯影劑(北京索萊寶有限公司)。

1.3 主要儀器CO2培養箱、超凈工作臺(美國Thermo Fisher Scientific公司)；酶標儀(美國BioTek公司)；Countstar全自動細胞計數儀(美國Countstar公司)流式細胞分析儀(美國BD公司)；離心機(美國Eppendorf公司)；電泳系統、凝膠成像系統(美國Bio-Rad公司)。

1.4 方法

1.4.1HMA靶點分析 采用中藥系統藥理學數據庫和分析平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform, TCMSP, https://tcmspw.com/tcmsp.php)[6]研究HMA可能的靶點信息。在“Chemical name”下檢索關鍵詞“2-hydroxy-3-methylanthraquinone”，得到該化合物的相關信息和可能的靶點信息。

1.4.2細胞培養 將HCT116和HT-29細胞分別培養在含有10%FBS的McCoy′s 5A 培養基中，37 ℃、5% CO2培養箱中培養，細胞貼壁生長至融合80%～90%時，胰酶消化傳代。

1.4.3藥物制備 HMA加入適當DMSO震蕩混勻配置成終濃度為200 μmol/L的母液，超聲助溶30 min，使粉末充分溶解后分裝并-20 ℃保存。在細胞加藥時用完全培養基稀釋成工作濃度，即為0、25、50、100 μmol/L；0 μmol/L HMA溶液為不加HMA的純溶劑(DMSO)溶液。

1.4.4CCK-8檢測細胞活力 人結腸癌細胞在培養瓶中培養至對數生長期，以3×104個/ml接種于96孔板，過夜培養后，加入不同濃度(0、25、50、100 μmol/L)的HMA，干預48 h后每孔10 μl的CCK-8溶液混勻，培養箱避光孵育2 h，于450 nm波長測定吸光度值。計算HMA對結腸癌細胞的活力，細胞存活率(%)=(實驗組吸光度均值/對照組吸光度均值)×100%。

1.4.5臺盼藍染色細胞計數檢測細胞生長能力 取對數生長期細胞，以1×105/ml細胞接種于12孔板，過夜培養后分別加入不同濃度(0、25、50、100 μmol/L)的HMA藥物干預，培養48 h后消化收集細胞，重懸混勻細胞后與0.2%臺盼藍等體積混合，加入計數板中，Countstar全自動細胞計數儀分析細胞總數。

1.4.6集落形成檢測細胞存活能力 取對數生長期細胞，以2×105/ml細胞接種于6孔板，過夜培養后分別加入不同濃度(0、25、50、100 μmol/L)的HMA藥物干預，培養48 h后消化細胞，以500個/孔接種于12孔板中，連續培養8～12 d，每隔3 d換1次液，待肉眼看到集落時終止實驗，結晶紫染色觀察細胞集落形成情況，集落形成率(%)=(實驗組吸光度均值/對照組吸光度均值)×100%。

1.4.7Annexin V/PI雙染法檢測細胞凋亡 取對數生長期細胞，過夜培養后加入不同濃度(0、25、50、100 μmol/L)的HMA藥物干預，48 h后收集細胞，PBS洗細胞2次，用1×Annexin-binding buffer重懸細胞，將細胞濃度調整為1×106個/ml，每100 μl細胞懸液加入5 μl AnnexinV-FITC和5 μl碘化丙啶(PI)混勻，室溫避光反應30 min，流式細胞儀上機檢測，實驗結果采用ModfitLT version 3.0軟件依據在各個時期的DNA含量進行分析，每個樣本至少計數10 000個細胞。

1.4.8Western blot實驗檢測凋亡相關蛋白的表達 按照上述方式HMA干預后收集細胞，PBS洗滌后加入含PMSF裂解液，低溫高速離心后吸取上清液即為所需蛋白。BCA測定蛋白濃度后加入50 μg蛋白量上樣電泳，將膠上蛋白轉入PVDF膜后室溫封閉1 h，加入不同抗體(1 ∶1 000)4 ℃過夜孵育。經TBST清洗后加入對應二抗(1 ∶5 000)室溫孵育1 h，經TBST洗膜后化學發光顯影拍照。

2 結果

2.1 HMA基本信息TCMSP數據庫中檢索可得，HMA的分子式為C15H10O3，分子量：238.25，結構式見圖1，主要存在于白花蛇舌草、半枝蓮、巴戟天三種植物中，并獲得32個靶基因，結果如表1所示。其中包含Caspase-3等凋亡相關基因。

圖1 HMA化學結構式

2.2 HMA對結腸癌細胞生長的影響為了確定HMA對細胞增殖的影響，本研究采用細胞計數和CCK-8方法檢測HMA對結腸癌細胞活力的影響。CCK-8結果顯示，與對照組(0 μmol/L)相比，不同濃度的HMA對HCT116(圖2A)和HT-29(圖2B)細胞活性具有明顯的抑制作用，差異有統計學意義(P<0.05)。臺盼藍染色計數結果顯示，與對照組(0 μmol/L)相比，不同濃度的HMA干預HCT116(圖3A)和HT-29(圖3B)結腸癌細胞后，細胞數量明顯減少，差異有統計學意義(P<0.05)。表明HMA可抑制HCT116和HT-29細胞的生長。

2.3 HMA對結腸癌細胞存活能力的影響為了進一步驗證HMA對細胞增殖的影響，采用集落形成探討HMA對HCT116和HT-29細胞存活能力的影響。實驗結果顯示，在HCT116細胞中(圖4A)，與對照組(0 μmol/L)細胞集落形成率相比，25、50、100 μmol/L HMA干預組細胞集落形成率明顯降低，差異有統計學意義(F=38.894，P<0.05)；在HT-29細胞中(圖4B)，與對照組(0 μmol/L)細胞集落形成率相比，25、50、100 μmol/L HMA干預組細胞集落形成率亦呈減少趨勢，差異有統計學意義(F=12.886，P<0.05)，說明HMA可抑制結腸癌細胞的存活能力，進一步證實了HMA抑制結腸癌細胞的增殖。

表1 HMA潛在靶基因信息

2.4 HMA對結腸癌細胞凋亡的影響為了進一步探討HMA對大腸癌細胞凋亡的影響，采用Annexin V/PI雙染法檢測HMA對HCT116和HT-29細胞凋亡情況。實驗結果顯示(圖5)：在HCT116細胞中(圖5A)，與對照組(0 μmol/L)細胞凋亡率相比，25、50、100 μmol/L HMA干預組細胞凋亡率明顯提高，差異有統計學意義(F=29.122，P<0.05)；在HT-29細胞中(圖5B)，與對照組(0 μmol/L)細胞凋亡率相比，25、50、100 μmol/L HMA干預組細胞凋亡率亦有所升高，差異有統計學意義(F=15.779，P<0.05)，說明不同濃度的HMA可誘導細胞凋亡。

2.5 HMA對結腸癌細胞凋亡相關蛋白的影響Western blot結果顯示：與對照組比較，不同濃度的HMA干預大腸癌HCT116(圖6A)和HT-29(圖6B)細胞后可明顯升高活化形式的cleaved Caspase-9和cleaved Caspase-3、Bax的蛋白表達，同時降低Bcl-2的蛋白表達。

3 討論

結腸癌是我國最常見惡性腫瘤，其發病率和病死率均居消化系統惡性腫瘤第一位，其發生發展是一個涉及多基因、多步驟的癌變過程。結腸癌早期癥狀不明顯，診斷困難，臨床確診時患者已處于中晚期，錯失最佳治療時機。盡管手術治療仍為結腸癌的首選方案，但對于中晚期結腸癌患者來說，不適宜手術治療，常以放化療或臨床藥物控制，但存在靶點單一、途徑單一和不同程度的毒副作用，影響患者的生存質量和預后。

本課題采用臺盼藍染色法、CCK-8法和集落形成實驗檢測不同濃度HMA藥物對結腸癌HCT116和HT-29細胞的生長和存活能力，實驗結果表明不同濃度(25、50、100 μmol/L)的HMA均能明顯抑制結腸癌HCT116和HT-29細胞的生長，且對HCT116細胞的抑制效果更顯著。白花蛇舌草有名二葉葎、白花十字草、尖刀草，屬茜草科耳草屬1年生披散草本植物。該藥最早記載于《廣西中藥志》，其味苦、甘，性寒，歸肺、胃、大腸、小腸經，全草皆可入藥，內服外用均可。傳統中醫藥理論認為本品苦寒清泄，甘寒滲利，具有清熱解毒、消痛散結、利尿除濕之功效，可用于治療癰腫瘡毒、咽喉腫痛、毒蛇咬傷、熱淋澀痛及癌腫等癥狀。現代藥理研究發現，白花蛇舌草具有抗腫瘤、調節免疫、抗感染以及抗氧化等藥理活性。近年來，百花蛇舌草在多種人類惡性腫瘤中應用廣泛，研究報道白花蛇舌草、半枝蓮等清熱解毒類中藥臨床常用于腫瘤、熱癥等疾病治療[9]，在體內外實驗均證實對大腸癌生長、轉移等具有明顯的抑制作用[10]。HMA為一種蒽醌類活性成分，存在于中藥白花蛇舌草、半枝蓮等中草藥。研究[11]報道表明HMA對白血病、卵巢癌、乳腺癌、肺癌、肝癌等多種腫瘤細胞具有明顯的增殖抑制作用，但在結腸中抗癌機制較少。本研究結果初步表明，HMA對結腸癌細胞增殖具有抑制作用。

圖2 不同濃度HMA對HCT116(A)和HT-29(B)細胞活力的影響

圖3 不同濃度HMA對HCT116(A)和HT-29(B)細胞數的影響

圖4 不同濃度HMA對HCT116(A)和HT-29(B)細胞集落形成的影響

圖5 不同濃度HMA對HCT116(A)和HT-29(B)細胞凋亡的影響

圖6 不同濃度HMA對HCT116(A)和HT-29(B)細胞凋亡相關蛋白表達的影響

細胞凋亡是機體常見的正常生理過程，是生物體細胞在特定信號誘導下、凋亡相關基因調控下發生的一種程序性死亡過程，作用機制極為復雜[12]。細胞凋亡與半胱氨酸蛋白酶(Caspase)的激活有關，對大部分腫瘤都有實際意義。其中Caspase-9是位于凋亡級聯效應的上游的主要凋亡啟動因子，Caspase-3位于Caspases級聯反應的下游，被認為是Caspase家族成員中最重要的凋亡執行者，激活后可以誘導細胞凋亡[13]。本研究采用Annexin V/PI雙染法分析不同濃度的HMA對結腸癌HCT116和HT-29細胞凋亡情況，并通過WB法檢測HMA對凋亡相關蛋白表達的影響。分析結果顯示，不同濃度的HMA可以誘導結腸癌細胞凋亡，且呈濃度依賴性；同時HMA可明顯升高活化形式的cleaved Caspase-9和cleaved Caspase-3、Bax的蛋白表達，同時降低Bcl-2的蛋白表達。抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax是細胞增殖和凋亡的重要調控蛋白，兩者共同形成一個凋亡調節系統，Bcl-2 通過與Bax 競爭結合形成異源二聚體從而抑制或促進細胞凋亡[14]。Caspases是一個在細胞凋亡中起關鍵作用的酶家族，又被稱凋亡蛋白酶，執行細胞凋亡效應主要是通過凋亡效應因子Caspase-3蛋白活化而實現的，同時Caspase-3的活化又主要依靠凋亡啟動因子Caspase-9的激活。Bcl-2屬原癌基因，定位于線粒體膜上，高表達的Bcl-2可抑制細胞凋亡。Bax主要定位于細胞質，當受到凋亡信號刺激時，從細胞質遷移至線粒體外膜，并發生構象變化、寡聚化，介導下游凋亡分子釋放，從而引發細胞凋亡。既往研究顯示[15]，白花蛇舌草有效成分HMA有效抑制人肝癌HepG2細胞增殖，上調促凋亡基因Bax、Caspase-9 mRNA表達，誘導細胞凋亡。本研究結果說明HMA能以劑量依賴性誘導HCT116 和HT-29細胞凋亡，可能是通過下調Bcl-2的表達，上調Bax表達，并活化Caspase-9和Caspase-3的表達水平。從而促進結腸癌細胞凋亡。

綜上所述，本研究證實HMA對結腸癌細胞株HCT116和HT-29細胞具有抑制生長和誘導凋亡的作用，可能是通過調控Bcl-2和Bax等相關凋亡蛋白的表達，但仍存在一定局限性，仍有待進一步采用RNA測序等組學技術開展更深入的機制研究。