人參皂苷Rb1改善局灶性CIRI小鼠模型神經損傷的調控機制研究

周 璐，陳 珊，趙 雪，龍婷婷，朱俊德

根據2020年中國卒中報告，2019年我國新發卒中394萬例，其中缺血性卒中287萬例，約占卒中患者的72.84%[1]。它是一種高致殘、高死亡率的疾病，嚴重危害人類的健康。腦缺血再灌注損傷(cerebral ischemia reperfusion injury，CIRI)是腦組織缺血后，恢復血液供應時誘發的功能障礙加重的現象，減輕CIRI的損傷對改善腦缺血卒中的治療有極大作用。此外，由CIRI導致的遲發性神經損傷會嚴重影響患者預后和神經功能的恢復。Wnt信號通路與增殖、凋亡、遷移和分化等多種生理病理過程密切相關。當Wnt通路激活時，GSK-3β功能和β-catenin降解受到抑制，β-catenin大量聚集并進入細胞核內，啟動下游基因的轉錄與翻譯，發揮調控細胞代謝的功能[2-3]。研究[4-6]表明，經典的Wnt/β-catenin信號通路可以在整個生命周期中維持血腦屏障特征。

1 材料與方法

1.1 實驗動物60只C 57/BL小鼠(5～8周齡，20～25 g)由重慶恩斯維爾生物科技有限公司提供。小鼠的飼養環境為(25±1) ℃，12 h光照/12 h黑暗循環，自由進食和飲水。動物實驗方案經貴州醫科大學倫理委員會批準(No.2200094)，并嚴格按照其指導方針進行。

小鼠隨機分為6組，每組10只，即假手術組、CIRI模型組、人參皂苷Rb1低劑量組、人參皂苷Rb1中劑量組、人參皂苷Rb1高劑量組和尼莫地平(陽性對照)組。假手術組：行假手術，腹腔注射生理鹽水。CIRI模型組：缺血手術，再灌注前10 min予腹腔注射生理鹽水。人參皂苷Rb1低、中、高劑量組和陽性藥物組：缺血手術后，再灌注前10 min分別腹腔注射人參皂苷Rb1 20、40、80 mg/kg和尼莫地平1 mg/kg。

1.2 局灶性腦缺血再灌注損傷模型制備小鼠適應性飼養1周后，進行大腦中動脈閉塞手術。麻醉后，顯露左頸總動脈并使用動脈夾夾住。在手術過程中，使用手術臺上的加熱墊將體溫保持在36.5～37.0 ℃。切口區域用聚維酮碘溶液消毒。分離并結扎頸外動脈。將帶有鈍頭(直徑0.35 mm)的尼龍縫線拉入頸外動脈，然后拉入頸內動脈。大腦中動脈被頸動脈分叉遠側18 mm處的縫線阻塞。缺血再灌注損傷通過在閉塞2 h后去除縫合線來執行。在切口閉合后，將小鼠放回籠子，并提供食物和水。

1.3 試劑與儀器人參皂苷Rb1購自北京索萊寶生物科技有限公司；生物素標記的人參皂苷Rb1從Isolife公司(芬蘭)購買；RNAiso Plus裂解液購自Takara公司；反轉錄試劑盒購自北京擎科生物科技有限公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒購自碧云天生物技術公司；糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β)、Wnt3a、Wnt1、β-連鎖蛋白(β-catenin)、β-actin以及辣根過氧化物酶偶聯二抗抗體均購自武漢愛博泰克生物科技有限公司(Abclonal)； Mshot MF53顯微鏡(廣州市明美光電技術有限公司)；BioRad成像系統(美國BioRad公司)。

1.4 神經功能評分動物造模手術24 h后，按照MasaoShmiizu-Sasamata的方法對所有小鼠進行神經行為評分，評分標準包括：① 自主活動的程度，② 左前肢偏癱，③ 提尾時左前肢伸不直，④ 抗側推能力，⑤ 向左傾斜度，⑥ 向左環形度，⑦ 對觸須的反應。以上指標無異常為0分，中等異常為1分，嚴重異常為2分；各項評分相加，總分為0～14分[7]。

1.5 行為學測試利用平衡木實驗、Y迷宮實驗和懸尾實驗對小鼠的行為學能力進行測試。平衡木實驗方法：將小鼠放置于方形平衡木(長1 m，寬14 mm)一側，另一側放方形木盒，記錄小鼠60 s內通過平衡木時間。訓練2次，第3次正式實驗。未能達到另一側或超過60 s均記錄為60 s。Y迷宮實驗方法：由三個支臂和一個連接區組成，三臂相互夾角為120°，每臂末部鋪以食物槽，用以盛放食物。各臂可依次分為起步區、錯誤臂以及正確臂。通過訓練后記錄240 s內進入各臂時間，統計正確臂時間。懸尾實驗方法：提起小鼠尾部固定，使頭向下懸掛，300 s內記錄小鼠搖擺和攀爬情況。

1.6 尼氏染色小鼠海馬區腦組織樣本，4%多聚甲醛固定，切片，二甲苯脫蠟透明，將切片使用梯度酒精水化，雙蒸水清洗后，切片入甲酚紫染色，分化1～3 min后，二甲苯脫水，中性樹膠封固，使用顯微鏡對切片進行圖像采集。

1.7 qPCR使用RNAiso Plus裂解液提取組織總RNA，利用反轉錄試劑盒將總RNA反轉錄為cDNA，并進行qPCR檢測，反應體系為：2 ×T5 Fast qPCR Mix 10.0 μl；10 μmol/L Primer F 0.8 μl；10 μmol/L Primer R 0.8 μl；50 ×ROX Reference Dye II 0.4 μl；Template DNA 0.5 μl；ddH2O補充體系到20 μl。95 ℃反應30 s預變性，95 ℃ 5 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s(40個循環，延伸反應)，利用2-ΔΔCT法計算相對表達量。引物序列見表1。

1.8 Western blotBCA蛋白濃度測定試劑盒用于蛋白質樣品濃度測定，在95 ℃下加熱5 min，每泳道上樣30 μg，使用10% SDS-PAGE分離，然后電轉移到聚偏二氟乙烯膜(PVDF)上。將膜與GSK-3β(1 ∶500)、Wnt3a(1 ∶500)、 Wnt1(1 ∶500)、 β-cate-nin(1 ∶1 000)以及β-actin抗體(1 ∶2 000)4 ℃孵育過夜。用含有吐溫的Tris緩沖液(TBST)洗滌后，將膜與辣根過氧化物酶偶聯的二抗(1 ∶1 000)在室溫下孵育1 h，然后再次用TBST洗滌。增強的化學發光使抗體可視化，BioRad成像系統分析蛋白質條帶的密度。

表1 引物序列

1.9 免疫組化檢測海馬組織的石蠟切片烘干后，將切片(5 μm厚)脫蠟并使用3%過氧化氫修復組織抗原。將腦組織與小鼠GSK-3β(1 ∶50)、Wnt3a(1 ∶50)、Wnt1(1 ∶50)、β-catenin(1 ∶100)抗體孵育。最后，將組織與生物素標記的二抗(1 ∶500)一起孵育以觀察蛋白質表達。

1.10 分子對接與共沉淀實驗在Pubchem數據庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)獲取人參皂苷Rb1分子結構，在PDB數據庫(https://www.rcsb.org/)獲取β-catenin蛋白結構，利用AutoDock 4.2(美國Scripps研究所)進行分子對接預測與作圖。

將生物素標記的人參皂苷Rb1與親和素標記的磁珠在室溫孵育1 h。通過磁力架吸附磁珠后，清洗磁珠，再將磁珠與總蛋白孵育混合后，在垂直混合器上4 ℃孵育過夜。短暫離心后，在磁力架吸附磁珠，棄去上清液，清洗磁珠后加入洗脫液獲得與生物素標記的人參皂苷Rb1結合的蛋白質，Western blot法檢測其是否含有Wnt信號通路蛋白。

1.11 統計學處理所有數據均以平均值±標準偏差表示，使用單向方差分析和最小差異測試進行分析。所有統計分析均使用GraphPad Prism軟件(v.8.0.1，美國)進行。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 局灶性腦CIRI損傷小鼠模型構建為了研究人參皂苷Rb1對局灶性腦CIRI損傷小鼠模型的影響，利用手術構建局灶性腦CIRI損傷小鼠模型，并對小鼠模型進行平衡木試驗、Y迷宮試驗和懸尾試驗，隨后分離海馬體做組織水平和分子水平檢測，流程示意圖見圖1。結果表明，與假手術組比較，CIRI模型組小鼠神經功能評分明顯升高(P<0.05)；與CIRI模型組比較，人參皂苷Rb1低劑量組、人參皂苷Rb1中劑量組、人參皂苷Rb1高劑量組和尼莫地平(陽性對照)組小鼠神經功能評分顯著降低(P<0.05)(圖2A)。平衡木試驗中，統計分析表明，與CIRI模型組相比，人參皂苷Rb1低劑量組、人參皂苷Rb1中劑量組、人參皂苷Rb1高劑量組和尼莫地平(陽性對照)組能夠顯著降低小鼠通過平衡木時間(P<0.05)(圖2B)。Y迷宮試驗中，與模型組相比，人參皂苷Rb1低劑量組、人參皂苷Rb1中劑量組、人參皂苷Rb1高劑量組和尼莫地平(陽性對照)組均能夠顯著提高小鼠進入正確臂時間(P<0.05)(圖2C)。懸尾試驗中，添加人參皂苷Rb1后，與CIRI模型組相比，小鼠搖擺時間和攀爬時間增加(P<0.05)，見圖2D、2E。

圖1 局灶性腦CIRI損傷小鼠模型構建以及行為學檢測流程示意圖

2.2 人參皂苷Rb1能夠提高海馬體內尼氏體數量尼氏染色檢測海馬體中尼氏體數量變化，結果如圖3所示，可以明顯看到CIRI模型組中尼氏染色陽性率降低，人參皂苷Rb1中劑量組、人參皂苷Rb1高劑量組和尼莫地平(陽性對照)組尼氏染色陽性率有所恢復，染色強度強于CIRI模型組。

2.3 人參皂苷Rb1對Wnt信號通路調控作用Western blot結果表明，在CIRI模型組海馬體樣本中，與假手術組相比，GSK-3β蛋白升高(P<0.01,F=237.7)，見圖4A、4B，而Wnt3a(P<0.01,F=122.3)、Wnt1(P<0.01,F=71.59)和β-catenin(P<0.01,F=180.5)蛋白表達量降低，見4C-4E。人參皂苷Rb1低劑量組、人參皂苷Rb1中劑量組和人參皂苷Rb1高劑量組則能夠降低GSK-3β，提高Wnt3a、Wnt1和β-catenin蛋白表達量，差異有統計學意義，并且隨著劑量的增加，作用越顯著。免疫組化結果與Western blot結果趨勢一致，見圖5～8。

圖2 小鼠行為學檢測結果

圖3 尼氏染色檢測各組海馬體中尼氏體數量變化 ×200

通過分子對接發現人參皂苷Rb1與β-catenin蛋白可能存在直接結合作用(圖9A)，共沉淀試驗結果證明β-catenin蛋白與人參皂苷Rb1存在直接結合作用(圖9B)。進一步通過qPCR檢測發現人參皂苷Rb1處理后，海馬體中Axin2 mRNA表達量降低(P<0.05)，β-catenin mRNA表達量增加(P<0.05)(圖9C、9D)。

3 討論

天然產物可用于調節細胞因子活性以治療疾病。本研究結果表明天然產物人參的主要生物活性成分之一人參皂苷Rb1能改善大腦中動脈栓塞小鼠模型的神經功能并提高海馬體中尼氏體數量。人參皂苷Rb1治療后海馬體中Axin2和GSK-3β降低，Wnt3a、Wnt1和β-catenin表達量增加，差異有統計學意義，表明人參皂苷Rb1能夠激活Wnt信號通路，可能在卒中治療期間對局灶性CIRI具有神經保護作用。

許多研究[8-9]已經證明了人參皂苷Rb1在治療缺血性中風中的有益作用，人參皂苷Rb1可促進局灶性腦梗死小鼠的后期恢復，然而，人參皂苷Rb1功能的機制需要進一步研究。大腦中的氧化應激和炎癥反應是影響缺血性卒中的主要因素，可促進自由基釋放，導致腦組織氧化損傷[10]。有研究[11]表明人參皂苷Rb1能夠激活PI3K/AKT信號通路，調控細胞自噬，保護神經元免受缺血性損傷。也有研究[8]表明，在小鼠大腦中動脈栓塞再灌注模型中，腹腔注射人參皂苷Rb1可以有效保護血腦屏障，提高緊密連接蛋白的含量，抑制自由基的產生，保護血腦屏障完整性。本研究結果表明，在局灶性CIRI小鼠模型中，腹腔注射人參皂苷Rb1干預后，與CIRI模型組相比，人參皂苷Rb1低劑量組、人參皂苷Rb1

圖4 海馬體組織中GSK-3β、Wnt3a、Wnt1和β-catenin的蛋白表達

圖5 免疫組化法檢測海馬體組織中GSK-3β表達 ×400

Wnt/β-catenin信號通路在缺血性腦卒中的預防和損傷修復過程中發揮重要作用。以往研究[12-13]表明，Wnt/β-catenin信號通路在腦缺血再灌注損傷中起重要作用，參與神經干細胞的增殖、分化和軸突形成等過程。同時，該信號通路在血腦屏障的形成和維持、腦血管再生和重塑中也至關重要。Wnt蛋白廣泛存在于腦血管和血腦屏障中，可參與調節腦血管生成和血腦屏障分化。許多研究[6]已經證實腦缺血再灌注損傷可以激活Wnt/β-catenin信號通路，但該通路的激活是否保護或損傷組織尚存在爭議。本研究通過免疫組化與Western blot檢測顯示，人參皂苷Rb1能夠降低GSK-3β，提高Wnt3a、Wnt1和β-catenin蛋白表達量，并且隨著劑量的增加，作用越顯著。

圖6 免疫組化法檢測海馬體組織中Wnt3a表達 ×400

圖7 免疫組化法檢測海馬體組織中Wnt1表達 ×400

圖8 免疫組化法檢測海馬體組織中β-catenin表達 ×400

綜上所述，本研究表明人參皂苷Rb1對局灶性CIRI中的神經系統具有保護作用，能夠改善CIRI小鼠模型的神經功能并提高海馬體中尼氏體數量，人參皂苷Rb1通過與β-catenin結合激活Wnt信號通路可能在該過程中發揮重要作用。人參皂苷Rb1與激活Wnt信號通路相關，可能在卒中治療期間對局灶性CIRI具有神經保護作用。研究證明人參皂苷Rb1可能是一種很有前途的神經保護候選物，需要進一步的實驗室和臨床研究。

圖9 人參皂苷Rb1調控海馬體組織中基因表達