一種黏性止血雙網(wǎng)絡水凝膠的制備及性能評估

丁宇帆，蘇 睿，潘 釗，聞慧琴

大出血易并發(fā)休克危及生命一直是臨床棘手的問題，而早期止血可有效降低死亡率。近年來高質量止血材料的發(fā)展，為臨床提供了多重選擇，大大保障了人民生命健康安全[1]。富水性的水凝膠材料因與細胞外基質具有高度相似性，在生物醫(yī)學領域被廣泛研究。天然大分子水凝膠，如明膠、殼聚糖等，生物安全性高，但力學性能脆弱，特別是組織黏合性能的不足限制了其在止血領域的應用[2]。構建雙網(wǎng)絡水凝膠是一種穩(wěn)定天然大分子水凝膠結構、改善其力學性能的有效方法[3]。強生物黏附力可使材料牢固封堵出血位點。在水凝膠聚合物鏈中引入正電荷基團后，可以吸附聚積血液中表面帶負電荷的血細胞，通過化學途徑促進凝塊形成[4]。該研究通過光引發(fā)形成聚陽離子網(wǎng)絡，并與明膠網(wǎng)絡互穿，構建出力學性能優(yōu)異、表面帶有正電荷的雙網(wǎng)絡黏性水凝膠，并通過力學性能測試和體外止血效果評估此水凝膠用于控制出血的可行性。

1 材料與方法

1.1 合成材料及主要儀器合成材料：丙烯酰胺(acylamide，AM)，明膠(gelatin)，甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化銨(methacryloxyethyltrimethyl ammonium chloride，METAC)，光引發(fā)劑1173購自上海阿拉丁公司；N,N-亞甲基雙丙烯酰胺(methylene-bis-acrylamide，MBA)購自美國Sigma-Aldrich公司。

主要儀器：恒溫磁力攪拌器(S10-3，上海思樂儀器有限公司)，真空紫外箱(自主設計，購自淘寶)，力學萬能測試機(Instron 5565A，美國英斯特朗公司)，推注泵(LSP01-1BH，蘭格恒流泵有限公司)，掃描電子顯微鏡(ZeissMerlin Compact，德國蔡司基團)。

1.2 水凝膠前驅液的配制分別稱取明膠1.25 g、AM 2.17 g、METAC 3.64 g，置于避光小棕瓶中，加入少量MBA和光引發(fā)劑1173后添加去離子水11.4 ml。60 °C水浴攪拌加熱至固體溶解、溶液澄清透明備用。

1.3 水凝膠的制備及微觀形貌觀測將前驅液注入提前準備好的模板，氮氣保護下365 nm紫外燈交聯(lián)1h，脫模后制得目標水凝膠。將成功交聯(lián)的水凝膠凍干脫水、蒸金、制樣后使用掃描電鏡(SEM)拍攝其截面微觀形貌。

1.4 水凝膠力學性能的評價拉伸強度測試使用力學萬能測試機完成。將水凝膠材料裁剪為長7.5 cm、寬2.5 cm的樣品，以50 mm/min速度拉伸，記錄拉伸位移與載荷。在組織黏合性能測試中，選取新鮮豬皮、豬肝臟、豬主動脈、豬脾臟和豬心肌組織為測試基底，采用搭接剪切試驗(美國材料與試驗學會國際標準ASTMF2255)評估水凝膠對幾種組織基底的黏合性能。

1.5 水凝膠體外止血效果評估

1.5.1體外全血凝結實驗 將直徑8 mm的圓形水凝膠置于潔凈24孔板中，取170 μl健康成人抗凝全血(3.2%枸櫞酸鈉，1 ∶9)滴加在待測水凝膠樣品表面，加入10 μl氯化鈣(0.2 mol/L)重鈣化后，在所需時間點用生理鹽水輕柔洗滌各孔，去除未凝結的游離紅細胞，至清洗液呈無色透明狀，觀察各孔血液凝結狀況。將1 min時間點洗滌后水凝膠固定、凍干，拍攝SEM圖片。

1.5.2體外皮膚出血模擬 體外皮膚出血通路是以豬皮模擬人體皮膚，將健康成人抗凝全血(3.2%枸櫞酸鈉，1 ∶9)用推注泵以400、300、200、100 μl/min速度從豬皮表面人為制造的缺損處擠出，模擬出血時血液從皮膚創(chuàng)口流出的過程，缺損處使用水凝膠止血封堵后，觀察血液滲漏狀態(tài)。

1.6 水凝膠血液相容性洗滌全血后制備5% 紅細胞懸液，分別在生理鹽水、去離子水、水凝膠浸出液中加入200 μl上述紅細胞懸液，37 °C共同孵育15 min后，測量各組在540 nm處的吸光度，計算得到各組溶血率。

2 結果

2.1 水凝膠制備流程及形態(tài)365 nm紫外光照下，均勻分散的AM和METAC水溶液在光引發(fā)劑1173和交聯(lián)劑MBA的作用下聚合為聚METAC-AM陽離子水凝膠，與溶液中溫度響應交聯(lián)的明膠網(wǎng)絡互穿后形成雙網(wǎng)絡水凝膠(MA水凝膠)(圖1)。SEM結果(圖2A)顯示該方法聚合制備水凝膠具有典型的三維網(wǎng)絡結構。

2.2 力學性能評估拉伸強度采用拉伸測試，水凝膠的拉伸特征曲線以拉伸應變?yōu)闄M坐標，拉伸應力為縱坐標，結果如圖2B所示。相同條件下重復測試5個樣品，取平均值可得MA水凝膠的平均拉伸應變?yōu)?08.65%，平均拉伸應力可達46.42 kPa。

生物黏合能力使用接搭剪切試驗評估(圖3A)，分別用新鮮離體豬皮、豬肝臟、豬主動脈、豬脾臟、豬心臟作為測試基底，可觀察到MA水凝膠在各組織基底上呈現(xiàn)出不盡相同但趨勢一致的特征曲線(圖3B-3G)。多次測量統(tǒng)計后可發(fā)現(xiàn)五種組織基底中，MA水凝膠對豬皮的黏附力最大，動脈次之，脾臟和肝臟因表面光滑潮濕呈現(xiàn)最小的黏合力。

2.3 體外止血效果體外止血效果評估也分為兩部分。首先進行體外全血凝結試驗，由圖4A各孔結果可看出，10 s時可見MA水凝膠表面吸附有大量紅細胞，1 min時即形成肉眼可見凝塊。SEM觀察結果顯示，1 min時水凝膠表面可見少量纖維蛋白包裹的紅細胞和伸出偽足的血小板，說明血小板被激活、凝血級聯(lián)發(fā)生(圖4B)。

在體外皮膚出血模擬評估實驗(圖4C)中，以400、300、200、 100 μl/min等多個速度模擬自由出血20 s后，MA水凝膠在150 s內均可有效阻止血液從出血點泄露，明顯好于醫(yī)用紗布組(圖4D)，以200 μl/min的流速，使用150 s為示例。

2.4 血液相容性各組分別與紅細胞共孵育，測定并處理540 nm下吸光度值，得到圖4E。MA水凝膠的溶血率為4.51%，小于5%的國家標準，顯示材料良好的血液相容性。

圖2 MA水凝膠的理化性能

3 討論

創(chuàng)傷性出血不及時處理非常兇險，致殘致死率在臨床一直居高不下，因此早期快速止血、閉合創(chuàng)面是外科醫(yī)學的關鍵[5]。傳統(tǒng)止血材料以醫(yī)用紗布為代表，止血速度有限，且從創(chuàng)面移除時會對組織造成二次傷害。沸石類止血劑在緊急止血中應用廣泛，但止血時伴有大量放熱，易繼發(fā)不良反應。可代謝的纖維蛋白膠及人工合成氰基丙烯酸酯類膠黏劑近年來被應用于臨床。但纖維蛋白膠封堵效果受弱的力學性能限制，無法提供穩(wěn)定的止血能力；氰基丙烯酸酯類膠黏劑由于爆聚反應放出大量熱以及代謝產(chǎn)物的組織毒性使它無法應用于內腔止血[6]。

水凝膠因與人體細胞外基質的理化性質高度相似而在生物醫(yī)藥領域受到廣泛關注。針對傳統(tǒng)水凝膠材質較脆弱、力學性能不足的問題，北海道大學研究團隊成功構建了一種既強又韌的雙網(wǎng)絡水凝膠體系，被廣泛應用于各類水凝膠力學性能的改善，為水凝膠在生物醫(yī)學領域的運用提供材料基礎[7]。在此基礎上，陸軍軍醫(yī)大學研究團隊將凝血酶HC引入水凝膠，成功制備出“超級止血黏合劑”，將體外止血時間縮短至45 s[8]。麻省理工學院研究團隊仿照藤壺膠的作用原理，開發(fā)出一種在溫和壓力下15 s內與創(chuàng)面組織形成牢固黏附的水凝膠基糊劑，賦予其不依賴天然凝血機制的封堵止血功能[9]。雖然已發(fā)展的水凝膠止血材料體系性能優(yōu)異，但止血性能的發(fā)揮多依賴于單一的化學信號激活凝血系統(tǒng)，或物理封堵避免血液流失，鮮有同時利用兩種止血機制協(xié)同作用進一步提升水凝膠止血性能的報道。

圖3 MA水凝膠的生物黏合性能

圖4 MA水凝膠的止血性能評估

本研究構建了一種黏性止血雙網(wǎng)絡水凝膠，通過水凝膠分子鏈基團設計，實現(xiàn)物理化學協(xié)同止血機制。首先基于低免疫原型、生物相容性和可降解性的需求，采用天然高分子明膠作為強網(wǎng)絡[10]。以丙烯酰胺為主體材料[11]，以陽離子單體METAC為功能單元[12]，共聚形成柔性水凝膠網(wǎng)絡。拉伸強度測試揭示MA水凝膠具有優(yōu)異的拉伸性能，為材料閉合創(chuàng)口、封堵出血提供支撐作用。生物黏合性能測試發(fā)現(xiàn)，MA水凝膠對多種組織都具有非常牢固的黏合效果(圖2B、2C，圖3)，為材料閉合創(chuàng)口、封堵出血提供附著基礎。體外皮膚出血模擬實驗也證實MA水凝膠可有效封閉出血點，達到快速止血目的。MA水凝膠中METAC分子提供的豐富正電荷，與血液接觸后，可以快速中和紅細胞和血小板表面的負電荷，促進血細胞之間相互聚集，對血凝塊的形成和收縮起正向調控作用[13]。與此同時，明膠分子可以活化血小板，加速纖維蛋白網(wǎng)絡的生成[14]。體外全血凝結實驗顯示，MA水凝膠可有效地將凝塊出現(xiàn)時間從6 min縮減至1 min，表明MA水凝膠具有良好的促凝血能力。全血孵育后水凝膠的SEM觀察結果發(fā)現(xiàn)，發(fā)生凝血時，紅細胞與血小板首先黏附于材料上，隨后血小板被激活發(fā)生形變，互相聚集并連接纖維蛋白，促使纖維蛋白包裹在紅細胞表面，最終形成凝塊。但不能忽視的是丙烯酰胺類水凝膠的溶脹體積變化是其應用的限制之一，關于此種止血材料的研發(fā)應針對該類水凝膠吸水性的調控做進一步的延伸性研究。

綜上所述，本研究成功構建了一種黏性止血雙網(wǎng)絡水凝膠，通過與創(chuàng)口組織表面形成牢固黏合作用，實現(xiàn)物理封堵止血；同時水凝膠網(wǎng)絡中的陽離子活性基團，通過靜電相互作用，吸附帶負電的紅細胞和血小板，并激活化學凝血程序，實現(xiàn)化學止血。該水凝膠采用的物理化學協(xié)同止血機制，實現(xiàn)了快速、穩(wěn)定止血效果，為止血材料的設計提供新思路，為臨床出血管理技術的發(fā)展提供了材料基礎。