殼寡糖的制備及其對三硝基苯磺酸誘導的大鼠結腸炎模型的治療作用

胡 凱，何 歡，袁曉箏，喬 靜

炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)是臨床常見的慢性消化道疾病，包括克羅恩病和潰瘍性結腸炎[1]。炎癥性腸病的發病機制尚不明確，現有的研究支持黏膜免疫失調在IBD發病機制中的核心作用，進而導致黏膜屏障破壞和纖維化病變[2]。在腸道黏膜免疫中，核因子kappa-B(nuclear factor kappa-B, NF-κB)炎癥通路被激活，進一步誘導白細胞介素1β(interleukin 1 beta, IL-1β)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)的表達，過量的TNF-α進一步加劇炎癥反應[3]。

殼寡糖(chitosan oligosaccharide, COS)是一種海洋多糖，它是一種天然抗氧化劑。有研究[4]表明，COS具有免疫調節活性，包括抑制NF-κB信號通路的激活及其下游反應。關于COS治療IBD的相關研究尚少。該研究將COS用于2,4,6-三硝基苯磺酸(2,4,6-trinitro-benzene sulfonic acid, TNBS)誘導的大鼠實驗性結腸炎模型的治療，探究COS對炎癥、黏膜屏障和腸纖維化方面的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物 健康SPF級雄性Sprague-Dawley大鼠24只，體質量(200±20)g，購自安徽醫科大學實驗動物中心，飼養溫度(22±2)℃，濕度50%，12 h光照與12 h黑暗交替。

1.1.2主要材料 TNBS購自美國Sigma公司。殼聚糖購自青島弘海生物技術有限公司。IL-1β、TNF-α和白細胞介素6(interleukin 6, IL-6)ELISA試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司。NF-κB1抗體購自中國博士德生物工程有限公司。collagen I、α-SMA抗體購自美國Abcam公司。Masson染液試劑盒、糖原PAS染液購自南京建成生物工程研究所。

1.2 方法

1.2.1COS的制備與表征 取40 g殼聚糖于400 ml蒸餾水中，攪拌使其充分溶解，調節pH至5.5，將殼聚糖酶加到反應體系中，于40 ℃恒溫水浴鍋中攪拌反應48 h，之后65 ℃水浴反應1h來滅活殼聚糖酶。4 000 r/min離心10 min后收集反應產物，將產物置于-80 ℃過夜后進行真空冷凍干燥，得到酶解產物COS。對產物采用KBr壓片法進行紅外光譜(FTIR)檢測。電離質譜(ESI-MS)檢測：取20 mg COS樣品溶解于甲醇中，使用三重四級桿液質聯用系統生成樣品的電離質譜圖。薄層色譜法用來鑒定殼聚糖酶解產物，使用的展開劑為異丙醇、氨水和水。產物上樣量為1 μl，待不同的COS單體爬板完成后用大茴香醛顯色。核磁共振(1HNMR)檢測：稱取一定量的酶解產物樣品溶解在D2O中，震蕩溶解后轉移至核磁管中，管中加入數滴丙酮作為內參，采用核磁共振儀獲取COS的1HNMR圖譜。

1.2.2動物模型的構建和管理 實驗大鼠適應性飼養1周，采用隨機分組法將大鼠均分為正常對照組(CON)、結腸炎模型組(TNBS)、5-氨基水楊酸(5-aminosalicylic acid, 5-ASA)治療組(TNBS+5-ASA)、COS治療組(TNBS+COS)。大鼠造模前12 h禁食，將1根直徑約2 mm 連接5 ml注射器的導管由肛門緩慢插入結腸腔內約8 cm處，隨后將1 ml結腸炎誘導劑(50%乙醇溶液為溶劑+100 mg/kg TNBS)推入導管，最后將大鼠尾巴提起，持續倒置1 min。造模結束后第2天開始灌胃給予治療劑0.5 ml，灌腸劑及治療劑設置如下：CON組(50%乙醇溶液+蒸餾水)、TNBS組(結腸炎誘導劑+蒸餾水)、TNBS+5-ASA組(結腸炎誘導劑+120 mg/kg 5-ASA)、TNBS+COS組(結腸炎誘導劑+120 mg/kg COS)。每天給藥1次，連續14 d。使用內窺鏡對大鼠結腸進行觀察。實驗期間對疾病活動指數(disease activity index, DAI)進行評估，評分標準見表1[5]。在灌胃后的第14天，戊巴比妥鈉腹腔麻醉大鼠，腹主動脈取血，3 000 r/min離心10 min，分離血清置于-80 ℃冰箱保存，用于細胞因子檢測。分離結腸組織，拍照后取病變明顯處分別用于固定包埋，5 μm切片，進行蘇木精-伊紅(HE)染色、糖原PAS染色、Masson染色及免疫組織化學染色。

表1 DAI評分

1.2.3組織病理學檢查 病理染色后，光學顯微鏡下隨機選擇10個視野進行觀察，并進行組織病理學計數和評分[6]。

1.2.4細胞因子和生化指標測定 ELISA試劑盒檢測各組大鼠血清IL-1β、TNF-α和IL-6的含量。血細胞分析儀檢測全血中紅細胞(red blood cell, RBC)、血紅蛋白(hemoglobin, HGB)、血清總蛋白(total protein, TP)和血漿白蛋白(albumin, ALB)含量。

1.2.5免疫組化檢測 檢測結腸組織中NF-κB1、collagen I和α-SMA的表達。NF-κB1、collagen Ⅰ、α-SMA的一抗稀釋濃度分別為1 ∶100、1 ∶200和1 ∶500，以磷酸鹽緩沖液(PBS)作為陰性對照。使用ImageJ軟件對陽性表達區域進行統計。

2 結果

2.2 大鼠日常狀態觀察和體質量變化CON組大鼠精神狀態良好、毛色光澤、活動靈敏、飲食水正常。造模大鼠在TNBS造模處理后第2天出現異常，TNBS造成的結腸損傷明顯，大鼠飲食飲水量明顯減少，出現腹瀉，動作遲緩，精神萎靡不振，體質量下降。大部分出現便血。使用內窺鏡對大鼠結腸進行觀察(圖2A)，與TNBS組相比，TNBS+COS組恢復的更快。TNBS組DAI評分高于TNBS+COS組(P<0.01)(圖2C)。

2.3 COS對結腸炎大鼠腸道功能恢復的影響大鼠的血液學分析表明(表2)，與TNBS組相比，TNBS+COS組的HGB顯著升高(P<0.01)。COS治療后增加了血漿蛋白含量(TP和ALB)(P<0.01)。

2.4 COS對結腸炎大鼠結腸組織病理的影響大鼠結腸組織的HE染色結果如圖所示，TNBS造成的損傷明顯，TNBS組黏膜層空泡變性并伴有強烈的炎癥浸潤、肌肉層變性和腸系膜增生(圖3A)。與TNBS組相比，TNBS+COS組減輕了炎癥浸潤(P<0.01)。Masson染色顯示與CON組相比，TNBS組明顯的膠原纖維增多(圖3B)。COS治療組細胞外基質沉積與TNBS組有顯著性差異(P<0.01)。

圖1 COS的表征

TNBS的誘導不僅使杯狀細胞數量減少，還引起杯狀細胞空泡變形，導致黏膜層破壞。與TNBS組相比，COS組的杯狀細胞數量增多(P<0.01)。

2.5 COS對結腸炎大鼠血清細胞因子的影響通過ELISA法檢測大鼠血清中的細胞因子含量，結果顯示，與TNBS組相比，TNBS+COS組IL-1β、TNF-α、IL-6水平均下降(P<0.01)，見表3。

2.6 COS對結腸炎大鼠結腸NF-κB1、collagen Ⅰ、α-SMA表達的的影響通過免疫組化檢測大鼠結腸組織的NF-κB1的表達，與TNBS組相比，COS處理后NF-κB1表達下降(圖4A)(P<0.01)。免疫組化的結果顯示，與TNBS+COS組相比，TNBS組出現明顯的collagen Ⅰ和α-SMA陽性區域。TNBS+COS組α-SMA表達減少與TNBS組有顯著性差異(P<0.01)。

3 討論

IBD是一種腸道慢性炎癥性疾病，近年來發病率逐年升高并且難以治愈。目前臨床上主要使用5-ASA制劑、免疫抑制劑和糖皮質激素來治療，但是均存在藥物不良反應，因此尋找開發一種新型安全的藥物顯得尤為重要。

COS是無毒害作用的小分子海洋天然產物，容易被機體吸收，具有很多被證實的生物學功能。在生物醫藥方面，COS能抑制腫瘤細胞的增殖并起到免疫調節作用，在生物醫學工程方面COS可用做基因遞送的載體、抗菌材料、表皮傷口敷料等，其緩解炎癥作用已得到公認和重視[7]。但是將COS的抗炎作用運用到IBD治療方面的報道很少。本研究使用已經成熟的TNBS誘導的實驗性大鼠結腸炎模型技術，利用120 mg/kg COS進行干預治療。TNBS刺激腸道上皮會導致巨噬細胞過度活化，釋放大量的炎癥因子IL-6、TNF-α等，從而造成炎癥[8-9]。因此，抑制炎癥因子的釋放有利于減輕炎癥反應。在腸道上皮細胞的細胞實驗中，COS則被證實能抑制這些炎癥因子釋放[10-11]。LPS誘導RAW264.7細胞中IL-6、TNF-α過量表達，COS干預后能夠抑制他們的上調[12]。與上述結果一致的是，本研究檢測大鼠血清中炎癥因子含量，發現COS處理后能有效緩解TNBS誘導的IL-6、TNF-α上調。

圖2 大鼠日常狀態觀察

表2 各組大鼠血液中RBC、HGB、TP和ALB含量變化

圖3 結腸組織病理染色結果

表3 大鼠血清細胞因子含量

圖4 結腸組織免疫組化結果

腸道組織是體內重要的免疫代謝調控器官，其穩態的維持對于腸道生理功能的發揮和抵抗病原微生物的侵入至關重要。在健康的結腸中，黏液層厚達1 mm，并且每小時進行一次完整的更新，主要是由杯狀細胞形成[13]。通過對大鼠結腸的PAS染色結果觀察可知，TNBS組大鼠的腸道杯狀細胞數量減少。而經過COS處理后，以上情況得到了緩解。說明COS通過增加杯狀細胞數量來改善腸道屏障功能。

肌成纖維細胞的轉分化以α-SMA標志蛋白為主要形態學特征，在腸道纖維化發生和發展中起到至關重要的作用[14]。Masson染色結果顯示COS干預后能明顯緩解由TNBS誘導的結腸炎大鼠模型腸道collagen Ⅰ和α-SMA的表達，減緩纖維化的進展，表明COS可能參與抑制腸道纖維化的過程。

綜上所述，本研究結果表明COS是一種安全有效的實驗性IBD治療藥物，能夠抑制炎癥反應相關因子、改善大鼠結腸組織膠原纖維沉積引起的纖維化病變，同時恢復腸道黏膜屏障。本研究結果為IBD的治療提供了一個潛在的候選藥物。