人皮膚表皮干細胞外泌體的分離培養與鑒定

李碧優 ，馬 潔，張啟宇，章華兵，朱云平,

表皮干細胞(epidermal stem cells，EPSCs)主要位于表皮細胞的基底層。在皮膚創傷時，可從基底層遷移到創傷部位，促進傷口的修復和愈合[1]。EPSCs 隨年齡增長逐漸減少，因此分離培養 EPSCs變得尤為重要，而人源 EPSCs 的分離和培養一直存在易污染、易分化的難點[2]。外泌體(exosomes, EVs)直徑在30～150 nm的細胞外囊泡[3]，干細胞是最常見的外泌體分泌細胞[4]，相比干細胞，外泌體免疫原性低，內容物穩定易保存，以及易于量產等優點。外泌體的分離和提取一直是外泌體研究的難點[5]。

目前干細胞外泌體研究主要聚焦于間充質干細胞和脂肪干細胞，大都來源于大小鼠或細胞系[6]，人源表皮干細胞外泌體(epidermal stem cells-exosomes，EPSCs-Exo)的研究甚少。該研究聚焦于體外分離培養人源 EPSCs，并探究EPSCs-Exo 體外分離純化方法，為進一步研究人源 EPSCs-Exo生物學功能及作用機制提供實驗基礎，實現其臨床治療和轉化。

1 材料與方法

1.1 組織來源皮膚組織來源于北京協和醫院。經北京協和醫院倫理委員會批準，倫理號：ZS-2556，本研究中共使用了 3 例男性患者的皮膚組織，年齡為 30～40歲，無其他疾病。患者本人知情同意，在進行包皮手術時，取多余的包皮組織用于分離EPSCs。

1.2 主要試劑Advanced DMEM/F12培養液、MEM非必需氨基酸溶液(NEAA，100×)、B-27無血清添加物(50×)、GlutaMAX(100×)、N-2羥乙基哌嗪-N-2-乙烷磺酸(HEPES, 1mol/L)、DispaseII酶、0.25%Trypsin/EDTA酶均購自Gibco公司。N-乙酰基-L-半胱氨酸(NAce，1 mmol/L)、TGFβ激活酶/激活素受體激酶抑制劑(A83-01)、人重組表皮生長因子(rhEGF)、wnt3a均購自Sigma-Aldrich公司。腺苷酸環化酶激活劑(Forskolin)購自Selleck公司，青霉素/鏈霉素(S/P，100×)、Matrigel膠購自Corning公司。兔抗人integrin-α6(貨號：27189-1-AP)、integrin-β1(貨號：12594-1-AP)、鼠抗人CD9(貨號：60232-1)、兔抗人Calnexin(貨號：10427-2)購自Proteintech公司，兔抗人Tsg101(貨號：125011)、CK19(貨號：ab52625)購自Abcam公司，兔抗人P63(貨號：D2K8X-13109)購自Cell Signaling Technology公司，兔抗人CD63(貨號：sc-5275)購自Santa Cruz公司，外泌體裂解液(貨號：UR33101)購自Umibio公司。

1.3 主要儀器CO2培養箱、低溫高速離心機、超高速低溫離心機(美國，Thermo Scientific)，電泳儀、半干轉轉膜儀(美國，Bio-Rad Laboratories)，超靈敏多功能凝膠成像系統(瑞典，Cytiva)，全電動倒置熒光顯微鏡(日本，Nikon)，透射電子顯微鏡(美國，捷克Delong Instruments)，納米流式分析儀(中國，福流生物)。

1.4 人EPSCs的分離培養EPSCs改良2D培養液的配置：在無菌環境下，向100 ml的Advanced DMEM/F12培養液中分別加入1 ml NEAA、2 ml B-27、1 ml GlutaMAX、1 ml HEPES、25 μl wnt3a、1 ml NAce、20 μl hEGF、10 μl A83-01、10 μl Forsklin、1 ml 青霉素/鏈霉素(S/P)雙抗配成培養液。

人包皮組織用含5×S/P、預冷的PBS緩沖液沖洗至無血污，剪去皮下的肌肉和脂肪，并切成1 cm2方塊大小；組織移至6孔板中，加入足量的Dispase II酶，37 ℃消化2 h，直至表皮和真皮輕松分離；用鑷子輕輕分離皮膚的表皮層和真皮層后，用含有5×S/P、預冷的PBS緩沖液分別進行清洗；將分離的表皮放入新的6孔板中，加入適量的0.25%Trypin-EDTA，消化5～10 min，待有大量單細胞和細胞團出現時終止消化，防止細胞消化過度，影響存活狀態。細胞懸液轉移到離心管，1 000 r/min 離心5 min，棄上清液，加入預冷的PBS洗滌3次，40 μm無菌篩網過濾，再次離心，棄上清液。EPSCs培養液重懸細胞沉淀，輕輕吹打混勻，加入Matrigel基質膠包被的6孔板中，37 ℃ 細胞培養箱中培養。每天拍照觀察，原代分離細胞首次2～3 d換液/次，待有較大的細胞克隆時改為1 d換液/次，以維持細胞生長所需要的營養。待細胞密度達到75% 左右進行傳代。醫院患者包皮樣本通過物理剝離和改良的Tryspin-EDTA酶的化學消化法，成功分離出人的EPSCs。

1.5 人EPSCs的鑒定EPSCs 含有多種蛋白，如整合素、核蛋白 P63。糖蛋白和角蛋白目前已經作為 EPSCs 常見的標志物[7]。本研究采用integrin-α6、integrin-β1、P63和 CK19 作為 EPSCs 的標志物，分別采用免疫熒光染色和Western blot 進行鑒定。

1.5.1人 EPSCs 標志蛋白的免疫熒光染色鑒定 6孔板中EPSCs用4%多聚甲醛固定30 min，滴加10%正常山羊血清，室溫封閉60 min；滴加抗integrin-β1單抗、抗P63單抗、抗CK19單抗于濕盒4 ℃過夜，加入相應的熒光二抗，室溫孵育1 h，DAPI染核后在熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.5.2人EPSCs標志蛋白的 Western blot鑒定 EPSCs用0.25%Trypsin/EDTA 酶消化 3～5 min, EPSCs重懸至 10 ml 的離心管中，1 200 r/min 離心 5 min,棄上清液，取6孔板，按照150 μl/孔加入混合裂解液(RIPA裂解液 ∶PMSF=100 ∶1)，吹打10～20次，冰上靜置 30 min 后轉入 1.5 ml EP管中，4 ℃、12 000 r/min 離心 15 min，取上清液，上清即目的蛋白，BCA法測蛋白濃度，配制 SDS-PAGE 凝膠行蛋白質電泳，將凝膠中的蛋白質轉移至 PVDF 膜，5% 脫脂奶粉封閉，用 integrin-α6(1 ∶500)、P63(1 ∶500)、CK19(1 ∶500)、GAPDH(1 ∶1 000)的一抗 4℃ 抗孵育過夜，TBST 清洗 3 次．添加辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗(1 ∶5 000)，室溫孵育1 h，TBST 清洗 3 次，加 ECL 發光液進行化學發光成像,檢測 integrin-α6、P63、CK19、GAPDH 的表達情況。

1.6 人EPSCs-Exo的分離與純化6孔板中的 EPSCs 以1 ∶4傳至 10 cm2的細胞培養皿中, 加入配置好的EPSCs培養液，待細胞密度至75%時，更換不含有因子的Advanced DMEM/F12的培養液，24 h收集細胞上清液，直至細胞邊緣透明化，停止收集。收集的細胞上清液暫時放置于4 ℃，長時間放置于-80 ℃儲存。收集P2-P5代的細胞上清液180 ml，4 ℃、1 348 r/min離心10 min，取上清液，3 692 r/min離心30 min，取上清液，4 ℃、33 028 r/min 離心2 h, 去除上清液，每管用5 ml預冷的PBS重懸，輕輕吹打重懸，再依次轉移到32 ml預冷的離心管中，并用預冷的PBS將體積補足至30 ml。 4 ℃、3 328 r/min離心 2.5 h，離心后輕輕吸去上清液，用 50～150 μl 的 PBS 重懸，得到外泌體，放至-80 ℃保存。

1.7 人EPSCs-Exo 的鑒定國際細胞外囊泡學會(ISEV)在 2014 年提議，對于分離獲得的外泌體需要從三個層面進行鑒定：① 透射電鏡(transmission electron microscope，TEM)鑒定外泌體形態；② 納米顆粒示蹤分析(nanoparticle tracking analysis, NTA)鑒定外泌體大小; ③ Western blot鑒定外泌體表面標志物[8]。國際囊泡學會在2018年進行了補充，對于鑒定外泌體表面標志蛋白，必須包含3個陽性蛋白和1個陰性蛋白對照，陽性蛋白位于外泌體膜上或者細胞內的蛋白，陰性蛋白表明分離的效率。在外泌體研究中，細胞膜蛋白CD63、CD9、CD81以及胞內Tsg101、Hsp70、Alix等是最常用的標志物[9-10]。本研究采用 Tsg101、CD9、CD63作為EPSCs-Exo的陽性標志物，Calnexin作為EPSCs-Exo的陰性標志物，采用Western blot進行鑒定，同時使用TEM和NTA法觀測外泌體形態及大小。

1.7.1TEM下觀察人EPSCs-Exo 采用 PBS 重懸提取的外泌體，滴于孔徑 2 nm 的載樣銅網上，室溫靜置 2 min，用濾紙從濾網側邊吸干液體，用3%磷鎢酸溶液在室溫下負染 5 min，濾紙吸干負染液，室溫晾干，使用透射電鏡觀察拍照。

1.7.2NTA法檢測人 EPSCs-Exo 將收集的外泌體顆粒通過光學顯微鏡收集其散射光信號及其在溶液中的布朗運動并進行拍照、追蹤和分析，從而計算出外泌體粒徑的大小和粒子的數目。

1.7.3Western blot法檢測人 EPSCs-Exo 標志蛋白表達 分離得到的外泌體與外泌體專用裂解液(1 ∶1)冰上裂解 10 min，4 ℃、33 028 r/min離心 5 min，吸取上清液加上樣緩沖液加熱變性，配制 SDS-PAGE 凝膠行蛋白質電泳，將凝膠中的蛋白質轉移至 PVDF 膜，5% 脫脂奶粉封閉，加入 Tsg101(1 ∶1 000)、CD9(1 ∶1 000)、CD63(1 ∶200)、Calnexin(1 ∶500)的一抗，4 ℃孵育過夜，TBST 清洗 3 次．添加辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗(1 ∶5 000)，室溫孵育 1 h，TBST 清洗 3 次，加ECL發光液進行化學發光成像，檢測 Tsg101、CD9、CD63、Calnexin、GAPDH 的表達情況。

2 結果

2.1 人皮膚組織分離EPSCs將用4%多聚甲醛固定 24 h 的 2 cm2大小的包皮組織用石蠟進行包埋，切成4 μm厚的切片，對石蠟切片進行免疫熒光染色，結果顯示，核蛋白 P63、CK14、CK10 在皮膚組織中均表達陽性并呈分層狀(圖1)。核蛋白 P63 在皮膚組織具有增生潛能的基底層表達，表明細胞具有增生的潛能；CK14 在組織的基底層表達，是短暫擴增細胞分化成EPSCs的階段；CK10 在皮膚組織表皮層表達，代表接近成熟的表皮細胞。通過皮膚組織染色進行 EPSCs 的組織溯源，顯示了表皮細胞從干性到成熟，不斷自我更新，從基底層、顆粒層、棘層、表皮層逐步遷移的過程，EPSCs可以來源于短暫擴增細胞或者分裂的 EPSCs，在空間上從基底層逐步分化成表皮細胞。

圖1 人皮膚組織免疫熒光染色結果 ×10

圖2 細胞貼壁法分離培養的EPSCs形態學觀察 ×10

2.2 人 EPSCs 的培養與鑒定

2.2.1人EPSCs的形態學觀察 原代培養的人皮膚 EPSCs，在 matrigel 膠包被的板子上貼壁生長，當細胞密度到達75%進行傳代，觀察分離后不同天數的細胞生長狀態。如圖3所示，在第2天時，原代細胞貼壁生長(圖2A)，在第4～7天時，細胞逐漸形成克隆(圖2B、2C)，在第10天時，細胞克隆已生長成可以傳代的密度，未分化的原代 EPSCs 排列整齊緊密，形態呈現規則的鋪路石狀，且細胞邊緣光滑(圖2D)。

2.2.2人EPSCs標志蛋白的鑒定 在細胞水平上，對P3代的EPSCs進行細胞免疫熒光染色，FITC熒光信號呈綠色，激發波長為488 nm, RFP熒光信號呈紅色，激發波長為568 nm。對integrin-β1(ITGB1)、P63用綠色熒光標記，CK19用紅色熒光標記，結果顯示在EPSCs中高度表達EPSCs的標志分子integrin-β1和P63，中度表達CK19(圖3A)。在蛋白水平上，將分離培養的EPSCs提取蛋白，對integrin-β1的同源標志物integrin-α6、P63、CK19和GAPDH進行Western blot分析，每組平行重復2個樣本，結果顯示EPSCs標志物integrin-α6、P63、CK19及GAPDH表達均呈陽性(圖3B)。這些結果說明分離培養的EPSCs純度較高，符合實驗的要求，為外泌體的分泌奠定了基礎。

2.3 人EPSCs-Exo的分離與純化將 EPSCs從P2-P5代加入改良的EPSCs 2D培養液進行培養，待其密度達到50%～60%時收集細胞上清液，連續收集3～5 d，共收集400 ml的細胞上清液，對收集的細胞上清液進行低速和超速離心獲得較純的EPSCs-Exo。EPSCs的上清液通過優化的低速和超速離心法依次去除死細胞、細胞碎片和其他細胞雜質，最終獲得高純度的EPSCs-Exo。

圖3 人EPSCs的鑒定

2.4 人EPSCs-Exo的鑒定通過TEM對EPSCs-Exo進行分析，結果顯示，EPSCs-Exo具有非常明顯的膜邊界，呈大小不一的茶托或杯狀結構(圖4A)。NTA法檢測結果表明，外泌體形態均勻，大小從80～150 nm，在127 nm處達到峰值,粒子數目為4.9E+9個(圖4B)。對優化的低速和超速離心獲得的EPSCs-Exo進行Western blot分析，結果顯示Tsg101、CD9、CD63這三個外泌體表面標志物在EPSCs-Exo和EPSCs表達均呈陽性，且EPSCs-Exo的表達比EPSCs的表達稍強，Calnexin、GAPDH在EPSCs的表達中呈陽性，在EPSCs-Exo中表達呈陰性，符合國際細胞外囊泡學會對外泌體鑒定的要求，表明EPSCs-Exo分離純度高(圖4C)。以上結果表明本研究成功分離獲得了純度較高的人EPSCs-Exo。

圖4 人EPSCs-Exo的特征鑒定

3 討論

皮膚作為人體最大的器官，在防止外界病菌侵入、保持體溫、防止水分蒸發、感受冷熱痛等功能方面尤為重要[9]。EPSCs是皮膚中具有自我增殖和修復能力的干細胞，在燒傷、遺傳性疾病引起的皮膚損傷等臨床治療研究中發揮了重要作用。本研究利用EPSCs慢周期性和自我增殖的特性[11]，改良了EPSCs 2D培養液，通過添加各種可以滋養EPSCs、對抗其分化的營養因子，維持EPSCs分裂性和增殖性，延緩EPSCs分化和成熟，增加了EPSCs原代分離后的生存率，可以連續培養4代人源的EPSCs。不同于其他鼠源和細胞系來源的EPSCs，本研究選用臨床患者的皮膚組織，運用細胞消化的方法，相比于組織培養法，細胞生長速度明顯加快，細胞污染的概率降低，為臨床提供了種子材料，有助于后續轉化醫學研究的開展。

不同干細胞分泌外泌體能力不同，目前尚未發表針對于人源EPSCs-Exo分離純化的技術。根據現已發表的研究，筆者嘗試參考脂肪干細胞和間充質干細胞外泌體的分離條件對EPSCs-Exo進行分離，發現低速離心次數太多、時間太長易導致EPSCs-Exo得率不高，且破壞其形態結構，無法獲得純度較高的EPSCs-Exo。因此筆者優化了差速離心條件：選用小轉速、短時間的低速離心和大轉速、長時間的超速離心法，成功獲得了高純度的人皮膚組織來源的EPSCs-Exo。

研究[4,12]表明，干細胞來源的外泌體可以有效轉運mRNA、microRNA及蛋白質等生物活性物質，具有減少細胞凋亡、減輕炎癥反應、促進血管生成、抑制纖維化、提高組織修復潛力等重要生物學功能，在調控組織再生方面存在良好的臨床應用前景。相比于EPSCs，EPSCs-Exo易獲取、無倫理審查的限制，可以穿過細胞膜到達細胞內發揮作用[13]；因此采用EPSCs-Exo代替EPSCs治療皮膚損傷將成為下一階段的研究熱點。而目前外泌體治療的技術難點在于外泌體分離和提取的難度大，純度低，產量低，損耗大，結果不穩定[14]。本研究擴大細胞上清液的收集量，優化差速離心條件的方法，調整轉速和超離時間，運用超速離心的方法，從而從細胞上清中穩定地提取到EPSCs-Exo。相比于PEG沉淀法、超濾、排阻等其他外泌體分離純化的方法，超速離心法的純度高，雜質少，為皮膚組織損傷修復提供了新的材料。

綜上所述，本研究運用改良的Tryspin-EDTA酶從人皮膚組織中成功分離出EPSCs，添加 EPSCs改良的 2D培養液在體外進行培養，延緩人EPSCs分化，增加了EPSCs的生存率，刺激其持續分泌EPSCs-Exo；通過優化超速離心的條件，高效高純度提取人源EPSCs-Exo。