磷酸二酯酶4D純合子敲除小鼠的構建

朱振鐸，蘇甜甜，程慧娟，江春如，方茹紅，管秋韻，何 鳳，葛明麗，魏 偉，汪慶童

磷酸二酯酶(phosphodiesterase, PDE)是21個基因編碼的11種不同亞型酶(PDE1-PDE11)的超級大家族[1]，PDE4D亞型在心臟、肝臟、腎臟等組織中表達較高。PDE4D的主要功能是通過與環磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)結合并將其降解為5′-腺嘌呤核苷酸(adenosine 5′-monophosphate，5′AMP)[2]。PDE4D表達升高會增加房顫的易感性和心源性中風的風險，也在非酒精性脂肪肝、阿爾茨海默病等疾病的發生發展中發揮重要作用[3]，PDE4D可能為這些疾病的潛在治療靶點。構建PDE4D基因敲除小鼠對充分闡明PDE4D的病理作用機制及藥物靶點的明確具有重要意義。該研究與江蘇集萃藥康生物科技有限公司合作，利用CRISPR/Cas9技術構建PDE4D基因純合敲除(PDE4D-/-)小鼠，對后代子鼠進行基因型鑒定，檢測PDE4D-/-小鼠主要器官組織中PDE4D蛋白的表達水平，超聲影像學和HE染色觀察小鼠主要器官形態、功能與組織學特征，從而驗證PDE4D-/-小鼠構建的結果，為以PDE4D為靶點的疾病和藥物研究提供基因工程動物模型。

1 材料與方法

1.1 實驗動物小鼠在SPF級實驗室飼養及繁殖。實驗室光照和黑暗時間各12 h交替，小鼠飼料、墊料以及飲用水均經過高溫高壓消毒滅菌處理。本研究經安徽醫科大學臨床藥理研究所動物實驗倫理審查委員會批準，倫理審查批準號為LLSC 20190307。

1.2 主要試劑及儀器PGK1.1線性載體由江蘇集萃藥康生物科技有限公司提供；核酸染料購自中國Meilunbio公司；瓊脂糖凝膠購自中國Biosharp公司；Genotyping Mix 購自中國Vazyme公司；抗 GAPDH抗體購自美國Proteintech公司；抗PDE4D抗體購自美國Proteintech公司；辣根酶標記的山羊抗鼠 IgG 購自美國Jackson公司。Tanon-1600全自動數碼凝膠圖像分析系統購自上海天能公司，Visual Sonics Vevo 2100系統購自加拿大 FUJI FILM公司，Pannoramic MIDI高分辨玻片掃描系統購自匈牙利3D HISTECH公司，Tanon-5200成像系統購自上海天能公司。

1.3 方法

1.3.1先導RNA載體構建 PDE4D基因共有20個轉錄本，由至少18個外顯子組成，分布在150 kb的基因組DNA上。根據PDE4D基因的結構特點，選擇PDE4D的外顯子4、外顯子5 (ENSMUST00000122041.7)為敲除區域，該區域包含229bp的編碼序列，敲除該區域將導致PDE4D蛋白質缺失(圖1)。利用CRISPR Design軟件設計篩選得到先導RNA(single guide RNA, sgRNA)，分別為5S1-(GTGAGCCGACTGTAAAGTGC)、5S2-(AAG GTACAACTTGGACCATC)、3S1-(AATGGGACCTTGA ATACCTT)、3S2-(AGATCTACCCAAGGTATTCA)，各自識別前間區序列鄰近基序CGG、CGG、GGG、AGG。構建sgRNA表達載體，將載體線性化和純化后作為模板用于體外轉錄。

1.3.2PDE4D-/-小鼠獲得 將Cas9 mRNA和轉錄后的sgRNA顯微注射到C57BL/6J小鼠的受精卵原核中，然后移植入C57BL/6J假孕雌性小鼠子宮中，繁育后獲得陽性F0(PDE4D+/-)小鼠，陽性F0代小鼠與C57BL/6J小鼠交配產生具有雜合基因型(PDE4D+/-)的穩定F1后代模型。PDE4D+/-小鼠之間進一步雜交產生F2代純合子小鼠(PDE4D-/-)，通過PCR和基因測序確認小鼠基因序列。

圖1 利用CRISPR/Cas9系統構建PDE4D基因敲除策略

1.3.3基因型鑒定

1.3.3.1鼠尾DNA的提取 子代小鼠在14日齡時剪尾，剪取組織長度約0.2 cm。在EP管中加入鼠尾裂解液(50 ml裂解液中含25 ml Tris HCl, 0.292 3 g NaCl, 10 ml EDTA pH=8, 0.5 g SDS, 37.5 ml ddH2O)和蛋白酶K(10 mg/ml)，渦旋后置入60 ℃水浴鍋過夜。次日煮沸10 min終止裂解。高速離心10 min去除組織或毛發殘留，吸取上清液，加入等體積預冷的異丙醇，上下輕柔顛倒。室溫靜置10 min，離心去上清液，加入預冷的70%乙醇溶液，離心去上清液。室溫30 min，待乙醇揮發，加入20 μl DEPC水，溶解作為DNA樣本保存在4 ℃。

1.3.3.2PCR擴增反應 引物設計策略為F1、R1針對KO小鼠設計，F2、R2針對野生型小鼠設計(圖2)。引物由上海生工公司合成。引物序列為F1(GCATGAAGGATACTTCCCAAGACTG)、R1(GACTGGGGTGCCTCTGAGCTTTTA)、F2(GAACAGACATAGAGCACCTTCCACA)、R2(CCTTGAGCCTGTTAGTGCTGGGAT)。PCR反應體系總體積共25μl，包含2×Taq Master Mix 12.5 μl，ddH2O 9.5 μl，正向引物1 μl，反向引物1 μl，DNA樣本1 μl。PCR反應程序依次為95 ℃ 5 min，(98 ℃ 30 s，65 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s)共20個循環，(98 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s)經過20個循環，72 ℃ 5 min, 4 ℃ 保存。

圖2 引物設計策略

1.3.3.3凝膠電泳 配制1%瓊脂糖凝膠電泳，瓊脂糖0.3 g加入1×TAE buffer 30 ml中。加入3 μl的核酸染料，取上述PCR擴增產物10 μl電泳，電壓120 V，電泳30 min，在全自動數碼凝膠圖像分析系統中觀察分析條帶。

1.3.4超聲影像學檢查 為評價PDE4D小鼠心臟結構和功能，用Visual Sonics Vevo 2100系統和MS 550探頭監測經胸超聲心動圖。褪去小鼠胸腹部毛發，異氟烷誘導麻醉。當小鼠被麻醉后，置于加熱墊上，心率保持在每分鐘400～500次。在B-mode下掃描短軸切面獲得乳頭肌切面，用M-mode分析心臟收縮功能，得到3個心臟周期的左心室射血分數(ejection fraction,EF)和左心室縮短分數(fractional shortening, FS)。使用脈沖波多普勒評估心臟舒張功能。從脈沖波多普勒頻譜波形中，測量二尖瓣E/A比值(mitral valve E to A ratio, MV E/A)、左心室等容舒張時間(left ventricular isovolumic relaxation time, IVRT)。轉換探頭角度獲取肝臟和腎臟的超聲圖像，觀察其所在位置、大小、形態及內部回聲情況。

1.3.5小鼠體質量和重要器官的HE染色 將野生型小鼠、PDE4D+/-和PDE4D-/-稱重后，麻醉小鼠處死取其心臟、肝、腎組織，用4%多聚甲醛固定，包埋在石蠟中切成4 μm的切片進行蘇木精-伊紅(HE)染色。使用高分辨玻片掃描系統收集HE染色的圖像。

1.3.6主要器官PDE4D蛋白水平檢測 麻醉小鼠后處死取其心臟、肝、腎提取組織蛋白。使用含有10 mmol/LPMSF和10 mmol/L磷酸酶抑制劑的裂解緩沖液中提取蛋白質。制備SDS聚丙烯酰胺凝膠，電泳，將目的蛋白轉移到PVDF膜上。5%脫脂牛奶37 ℃封閉2 h，在PDE4D一抗中4 ℃過夜。用相應的二抗在37 ℃下孵育2 h。最后在成像系統上應用ECL底物對膜進行成像，ImageJ軟件對條帶進行半定量分析。

2 結果

2.1 獲得PDE4D雜合敲除F1代小鼠將sgRNA顯微注射到C57BL/6J小鼠的受精卵中，獲得陽性F0代小鼠，通過基因測序對其進行基因型鑒定，測序結果比對野生型小鼠基因序列(圖3A)，可以確定在小鼠的基因組序列中，PDE4D基因缺失。為了構建穩定遺傳的PDE4D-/-小鼠，F0代PDE4D+/-小鼠與C57BL/6J小鼠交配得到F1代小鼠，編號為39、41、43、45。F1代子鼠DNA經過PCR擴增后，凝膠電泳結果顯示在383 bp處和385 bp處均有陽性條帶(圖3B)，表明成功繁育出PDE4D+/-小鼠。

圖3 F0代和F1代小鼠基因鑒定

2.2 獲得PDE4D基因純合敲除小鼠為獲得PDE4D-/-小鼠，F1代PDE4D雜合子小鼠交配繁育得到F2代小鼠，通過PCR擴增對其進行基因型鑒定(圖4)。編號13、21、33為純合子小鼠。凝膠電泳結果顯示編號13、21、33號在383 bp處有陽性條帶，而385 bp處沒有陽性條帶，提示成功建立PDE4D-/-小鼠，且具有穩定遺傳性。

圖4 F2代小鼠基因鑒定

2.3 驗證PDE4D敲除對小鼠體內主要臟器的影響與PDE4D+/+小鼠相比，PDE4D-/-小鼠外觀及生理表現未見明顯異常。稱重后發現同窩小鼠PDE4D敲除小鼠體質量相比于PDE4D+/+小鼠減輕(P<0.01)(圖5A)。獲取小鼠心臟、肝、腎等體內重要臟器的超聲圖像和超聲指標。超聲心動圖結果顯示PDE4D敲除小鼠心臟形態無明顯改變。紅圈和藍圈區分腎臟和肝臟超聲圖像。肝臟大小正常，包膜光滑，肝臟下緣角銳利。腎形態大小均一，腎實質回聲均勻(圖5B)。心臟收縮功能參數EF和FS與PDE4D+/+小鼠相比沒有明顯改變，心臟舒張功能參數E/A、IVRT指標也無明顯變化(圖5C)。小鼠麻醉后，取出其心臟、肝腎組織包埋后染色，HE結果顯示PDE4D-/-小鼠的心臟乳頭肌部位心肌細胞排列整齊，心肌細胞大小無明顯差異。肝細胞形態完整，胞核無明顯改變，肝小葉形態完整。腎臟組織結構正常，腎小球無萎縮，腎小管排列緊密(圖5D)。以上結果可提示PDE4D敲除對小鼠生長有抑制作用，但對體內重要器官心、肝、腎等無明顯影響。

2.4 PDE4D敲除小鼠體內PDE4D表達情況為驗證PDE4D小鼠的敲除情況，用PDE4D小鼠心臟、肝、腎提取組織蛋白。結果顯示，在心臟、肝臟、腎臟組織中，PDE4D+/-小鼠PDE4D蛋白表達與PDE4D+/+小鼠相比明顯降低(P<0.05)，PDE4D-/-小鼠PDE4D蛋白幾乎無表達(P<0.001)(圖6)，以上結果驗證了PDE4D基因在小鼠體內成功敲除，且敲除效果較好。

圖5 PDE4D+/+、PDE4D+/-和PDE4D-/-小鼠體質量及心、肝和腎的超聲圖像和心功能各指標變化和組織變化比較

圖6 PDE4D+/+、PDE4D+/-和PDE4D-/-小鼠主要組織中PDE4D的表達情況

3 討論

通過PCR擴增后凝膠電泳和基因測序技術以及Western blot實驗驗證PDE4D-/-小鼠PDE4D蛋白的表達情況，可以確定已經繁育出穩定遺傳的PDE4D純合子敲除小鼠。PDE4D-/-小鼠體質量比同年齡野生型小鼠低，有研究報道稱PED4D敲除小鼠生長延遲、排卵障礙、出生后生存能力降低[4]。PDE4D純合雌性小鼠表現出生育能力下降，研究者認為是排卵障礙和顆粒細胞對促性腺激素的敏感性降低所致。本研究顯示雌性PDE4D-/-小鼠生育率低于野生型小鼠，雌性PDE4D-/-小鼠每籠生育4～6只，野生型小鼠每籠生育6～8只。為確定敲除PDE4D后是否對體內臟器有影響，本研究采用超聲影像學技術檢測重要臟器心臟的功能、肝和腎的形態以及HE染色觀察心、肝、腎的病理變化，結果顯示PDE4D敲除小鼠體內主要器官無明顯的病變，可以確保下一步動物實驗的順利開展。

PDE4D屬于磷酸二酯酶家族，在心血管疾病、自身免疫性疾病、神經系統疾病、腫瘤等的發生發展中起到重要作用。PDE4D的表達是由胰島素受體、胰島素受體底物和G蛋白偶聯受體激酶2(G pro-tein-coupled receptor kinase 2，GRK2)和β-arrestin2依賴的β2腎上腺素受體(β2adrenergic receptor，β2AR)-細胞外調節蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)信號級聯反式激活介導。高脂飲食飼養使小鼠心臟中PDE4D的表達增加，導致心臟收縮和舒張功能障礙[5]。糖尿病大鼠心臟中同樣觀察到cAMP水平增加，PDE4D表達特異性上調[6]。PDE4D通過激活肝臟中的CD36-轉化生長因子-β1(transforming growth factor，TGF-β1)信號傳導，在非酒精性脂肪肝和相關高血壓的發病機制中起重要作用[7]。這些研究共同證實PDE4D是人體系統功能不可缺少的調節因子，正在逐漸成為臨床上疾病診斷治療靶點。因此，哺乳動物PDE4D敲除小鼠為特定疾病的病理生理機制的研究提供了非常有價值的動物模型。

雖然可以使用PDE4D抑制劑整體降低PDE4D的表達或活性用以探索其功能，但均存在局限性。常見的PDE4D抑制劑有多肽片段，重組腺相關病毒包裹的PDE4D短發夾RNA(short hairpin RNA，shRNA)和小分子化合物等。抑制性多肽的半衰期通常較短，給藥途徑受限；重組腺相關病毒的組織特異性較差，干擾效率差異較大。已知小分子化合物BPN14770和CP-671305可選擇性抑制PDE4D的活性，BPN14770對PDE4D3的半抑制濃度(half maximal inhibitory concentration, IC50)為7.4 nmol/L，對PDE4D7的抑制IC50為7.8 nmol/L，而對其他PDE4D亞型的抑制率有待確定，CP-671305抑制PDE4D的IC50為3 nmol/L，但在較大濃度時，其也可以抑制PDE4的其他同工酶[8]。采用CRISPR/Cas9基因編輯技術構建PDE4D基因敲除小鼠，具有成本較低、周期短和效率高等優點，可明確減少PDE4D的表達，為研究提供可靠的動物模型[9]。

綜上所述，本研究成功建立了可穩定遺傳的PDE4D純合敲除小鼠，敲除PDE4D未發現對體內主要臟器產生明顯的影響，可用于PDE4D為靶點的疾病模型探索和新藥研發。