PRC1在胰腺癌中的細胞生物學功能及臨床意義

馬丹丹，張 翌，林振宇，董慶泰，蕭正康，李中虎，張智勇，金煒東

胰腺癌是常見的消化道惡性腫瘤之一，發病率和病死率逐年上升，其五年生存率小于8%，80% ～ 85%的患者存在不可切除或轉移性疾病[1]。胰腺癌具有起病隱匿、進展迅速、侵襲能力強、總體預后差等特點，因此胰腺癌的診療給醫務工作者帶來巨大挑戰。尋找能夠早期篩查腫瘤的標志物迫在眉睫[2]。既往研究[3-5]表明胞質分裂調控蛋白1(protein regulating cytokinesis 1，PRC1)參與肝癌、胃癌、肺癌等多種惡性腫瘤的發生發展，均表現出癌基因特性，并與不良預后密切相關。但目前關于PRC1在胰腺癌中功能、臨床意義及機制研究的報道甚少，其在胰腺癌中的作用不明確。該研究旨在探索PRC1在胰腺癌中的表達及其與預后的關系、細胞生物學功能及可能的機制，以期為胰腺癌患者早期診斷及預后判斷提供新思路。

1 材料與方法

1.1 樣本來源收集中部戰區總醫院普通外科2021年1—12月收治住院接受手術治療的12例胰腺癌患者的組織標本及。此研究獲得本院倫理委員會批準，患者及家屬均簽署知情同意書。倫理審批文書批號：[2019]002-1。

1.2 試劑和儀器PRC1、GAPDH單克隆抗體及辣根過氧化物酶標記的二抗均購于美國Abcam公司(貨號：ab238427、ab245357、ab263962)。細胞凋亡檢測試劑盒(貨號：C1062M)購自碧云天生物科技有限公司，Matrigel基質膠(貨號：356234)購自美國BD公司，Transwell小室(貨號：3421)購自美國Corning公司。流式細胞儀(型號：Cyto Flex)購自貝克曼庫爾特生命科學公司，顯微鏡(型號：BX53)購自日本Olympus公司，顯影儀(型號：5100R)購自上海天能生物技術公司。人胰腺癌SW1990細胞株保存于本院中心實驗室。

1.3 GEPIA數據庫分析PRC1在胰腺癌組織及正常胰腺組織中的基因表達差異在GEPIA(http://gepia.cancer-pku.cn/)數據庫中設定條件為：“gene： PRC1”、“expression diy：boxplot”、“cancer type：PAAD”，可獲得PRC1在胰腺癌組織與正常胰腺組織中的表達差異。

1.4 免疫組織化學染色取出的組織常規甲醛固定包埋。玻片烤片、玻片脫蠟、抗原修復、內源性酶滅活。放于抗原修復盒中在室溫條件下1 h封閉，按照1 ∶100比例滴加適量PRC1抗體孵育液到玻片上進行一抗孵育，4 ℃過夜，洗凈一抗后加入辣根過氧化物酶標記的二抗(1 ∶1 000)孵育1 h。DAB顯色、依次將切片放入70%乙醇溶液、80%乙醇溶液、90%乙醇溶液、95%乙醇溶液、無水乙醇I、無水乙醇II、二甲苯I、二甲苯II中脫水透明，中性樹脂封片、每個組織樣本中選擇5 個視野拍照。

1.5 Western blot檢測提取蛋白，測量蛋白濃度，配置分離膠和濃縮膠、蛋白上樣、電泳、轉膜、室溫下封閉2 h，按照1 ∶1 000比例滴加PRC1抗體和GAPDH抗體孵育液進行一抗孵育，次日，加入1 ∶5 000 辣根過氧化物酶標記的二抗進行孵育。按照操作說明書配置顯影液等量混合，在顯影儀器中顯影、保存數據后統計分析。

1.6 細胞培養及轉染SW1990細胞培養于含10%胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)的DMEM培養基中，37 ℃、5%CO2培養箱中培養。細胞接種于6孔板，待貼壁后，使用陽離子脂質載體Lipofectamine 3000將pcDNA3.1-PRC1質粒轉染SW1990細胞作為過表達PRC1組(以PRC1表示)，將空載體pcDNA3.1-vector質粒轉染SW1990細胞作為其對照組(以Control表示)。靶向PRC1的小干擾RNA(SiRNA-PRC1)則根據NCBI數據庫中PRC1基因序列設計原則設計合成，設為沉默PRC1組(以SiRNA-PRC1表示)，同時合成隨機陰性對照組序列SiRNA-Control(以SiRNA-control表示)。

1.7 CCK-8法檢測細胞增殖胰酶消化各組細胞，制成細胞懸液，進行細胞計數。接種于96孔板，每孔加入100 μl含10%FBS的DMEM培養基，分別于培養24、48 h后加入CCK-8試劑 100 μl/孔，37 ℃培養箱孵育3 h后，在酶標儀上(設定波長450 nm)讀取吸光度值。

1.8 Transwell實驗檢測細胞侵襲胰酶消化各組細胞，細胞計數，調整細胞密度為1.0×108個/L。將無血清的DMEM培養基加入帶基質膠的Transwell小室上層，加入100 μl/孔細胞懸液。將600 μl含有FBS的培養基加入下室。培養箱中孵育48 h后，在室溫下每孔加入4%多聚甲醛1 ml，固定10 min，甲醇對細胞通透處理20 min，0.1%結晶紫染液染色20 min，棉簽擦去上室未遷移細胞，將Transwell小室膜切下，注意上下面，用不帶二甲苯的封片劑封片。在顯微鏡下200倍拍照觀察，統計結果。

1.9 流式細胞儀檢測細胞凋亡用胰酶消化各組細胞，制成細胞懸浮液，細胞計數，調整密度為6.0×105個/ml。培養48 h后，PBS清洗2次，室溫避光條件下，加入400 μl結合緩沖液重懸細胞，然后加入10 μl的 AnnexinV-FITC避光孵育15 min，再加入5 μl的碘化丙啶(PI)避光染色5 min。1 h內使用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.10 PRC1表達量數據獲取與分組在TCGA數據庫中，同時具有PRC1表達量數據及對應臨床病理資料的患者共174例。以胰腺癌患者PRC1 mRNA表達量的中位數為分割點將患者分為PRC1高表達組與PRC1低表達組。

1.11 STRING數據庫分析PRC1相互作用蛋白網絡在STRING數據庫主界面中搜索蛋白名稱“PRC1”，選擇物種“Homo sapiens”，獲得PRC1在人類細胞中的蛋白相互作用網絡。STRING數據庫的目的是收集和整合表達蛋白之間相互作用的所有功能，將已知和預測的大量生物體的蛋白質-蛋白質關聯數據合并起來。綜合得分(Combined score)越接近1越能表明蛋白分子間存在相互作用，分數越接近0 則表明蛋白分子間存在相互作用的可能性越低。

1.12 基因集富集分析本研究利用基因集富集分析(gene set enrichment analysis, GSEA)研究PRC1 mRNA表達水平與京都基因和基因組百科全書通路基因集的相關性。設定運行條件為：“Number of permutations”中選擇“1 000”，“Phenotype labels”中選擇“h_versus_l”, “Permutation type”中選擇“phenotype”。

1.13 統計學處理細胞實驗數據分析使用SPSS 26.0統計軟件，計量資料以均數±標準差表示，兩組間均數的比較用獨立樣本t檢驗。胰腺癌患者臨床病理特征與預后的關系采用Cox回歸分析，利用Kaplan-Meier法繪制胰腺癌患者生存曲線。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 數據庫中PRC1 mRNA基因表達變化GEPIA數據庫分析結果顯示，胰腺癌組織中的PRC1 mRNA表達量高于其在正常胰腺組織的表達，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖1。

2.2 免疫組織化學染色結果免疫組織化學染色結果顯示，在胰腺癌旁組織中，細胞排列整齊、形態規則，PRC1染色以淺黃色為主。在胰腺癌組織中，癌細胞排列紊亂、核大深染、形態不規則，PRC1染色以棕褐色為主，且定位于細胞質。見圖2。

圖1 數據庫中PRC1 mRNA基因表達變化

圖2 免疫組織化學染色結果 ×400

2.3 PRC1蛋白表達變化Western blot法檢測結果顯示，PRC1在胰腺癌組織中的蛋白表達顯著高于胰腺癌旁組織[(1.950 ± 0.151)vs(0.358 ± 0.079)，t=32.369，P<0.01]。見圖3。

2.4 細胞轉染效率的驗證針對PRC1的pcDNA3.1-PRC1質粒和SiRNA轉染人胰腺癌細胞系SW1990 48 h后，Western blot檢測結果顯示，PRC1組蛋白表達水平顯著高于Control組。SiRNA-PRC1組細胞中PRC1蛋白水平顯著低于SiRNA-control組。見圖4。因此，本研究設計的pcDNA3.1-PRC1能過表達PRC1，SiRNA-PRC1能沉默PRC1基因的表達，可用于進一步研究PRC1在胰腺癌細胞系SW1990中的細胞生物學功能。

圖3 PRC1蛋白表達變化

圖4 細胞轉染效率的驗證

2.5 PRC1對細胞增殖能力的影響CCK-8法檢測結果顯示，與Control組相比， PRC1組的細胞存活率顯著增高(t=-9.464、-13.883，P<0.01)。與SiRNA-control組相比，SiRNA-PRC1組的細胞存活率顯著降低(t=21.659、16.300，P<0.01)。表明過表達PRC1促進胰腺癌SW1990細胞增殖，而沉默PRC1則抑制胰腺癌SW1990細胞增殖。見圖5。

圖5 PRC1對細胞增殖能力的影響

2.6 PRC1對細胞凋亡率的影響流式細胞術檢測結果顯示， 過表達PRC1組細胞凋亡率顯著低于Control組(t=9.671，P=0.001)。SiRNA-PRC1組細胞凋亡率顯著高于SiRNA-control組(t=-9.515，P=0.001)。結果表明過表達PRC1抑制SW1990細胞凋亡，而沉默PRC1 可誘導SW1990細胞凋亡。見圖6。

2.7 PRC1對細胞侵襲能力的影響Transwell細胞侵襲實驗結果顯示：過表達PRC1組和Control組侵襲細胞數量分別為(47.667 ± 2.517)個、(30.667 ± 2.082)個。與Control組相比，過表達PRC1組侵襲的細胞數量明顯增多(t=-9.016，P=0.001)。SiRNA-PRC1組和SiRNA-Control組侵襲細胞數量分別為(23.000 ± 2.000)個、(33.667 ± 3.215)個。與SiRNA-Control組相比，SiRNA-PRC1組侵襲的細胞數量明顯減少(t=4.880，P=0.008)。表明過表達PRC1可促進SW1990細胞侵襲能力，沉默PRC1可抑制SW1990細胞侵襲能力。見圖7。

圖6 PRC1對細胞凋亡率的影響

圖7 PRC1對細胞侵襲能力的影響 ×200

表1 Cox回歸分析胰腺癌患者臨床病理特征與預后的關系

2.8 胰腺癌患者臨床病理特征與預后的關系PRC1基因表達水平與胰腺癌患者預后的相關性采用COX回歸分析。單因素COX分析結果顯示，PRC1 mRNA表達水平和M分期對胰腺癌患者的預后存在顯著影響(P<0.05)。將有統計學差異的臨床病理參數進一步納入多因素Cox分析，結果顯示PRC1 mRNA表達水平和M分期是胰腺癌患者預后的獨立危險因素(P<0.05)。見表1。

2.9 PRC1表達水平對胰腺癌患者生存率的影響根據PRC1 mRNA表達水平的中位數，將胰腺癌患者分為PRC1高表達組與PRC1低表達組。利用Kaplan-Meier法繪制患者生存曲線。結果表明PRC1高表達組胰腺癌患者的生存時間顯著低于PRC1低表達組患者(χ2=4.970，P=0.026，中位生存時間為517 dvs661 d)，見圖8。

圖8 PRC1表達水平對胰腺癌患者生存率間的影響

2.10 PRC1的蛋白相互作用網絡利用STRING數據庫分析人源PRC1可能存在的蛋白相互作用網絡圖，結果表明：與PRC1相互作用Score排名前10位的蛋白分別為PLK1(score=0.999)、KIF4A(score=0.997)、KIF20A (score=0.996)、KIF11(score=0.994)、KIF14(score=0.989)、CDK1(score=0.989)、TPX2(score=0.988)、RACGAP1(score=0.988)、CENPE(score=0.987)、NCAPG(score=0.986)，見圖9。

圖9 PRC1的蛋白相互作用網絡

2.11 PRC1的KEGG信號通路分析GSEA研究結果顯示：PRC1 mRNA高表達樣本富集到P53信號通路、Wnt信號通路、Notch信號通路等相關基因集(P<0.05)。見表2。

表2 PRC1的KEGG信號通路分析

3 討論

本研究利用生物信息學技術系統分析PRC1在胰腺癌中的表達差異及其對胰腺癌預后的診斷價值。結果顯示PRC1基因水平在胰腺癌中高表達，且PRC1高表達與胰腺癌的不良預后密切相關。同時Western blot檢測結果提示PRC1蛋白水平在胰腺癌中亦高表達，免疫組織化學染色結果顯示PRC1定位于細胞質。研究[5]表明PRC1在肺癌細胞系中過表達，PRC1的高表達與肺癌患者的預后不良有關，有望成為肺癌治療的潛在靶點。Chen et al[6]報道PRC1在肝癌中發揮致癌作用，PRC1高表達與早期肝癌復發和患者預后不良相關。Wang et al[7]進一步觀察到PRC1可使肝癌患者產生化療耐藥并預測術后不良預后。研究[8]結果提示PRC1的過表達預示著乳腺癌患者預后的無病生存率較低。Bu et al[9]研究結果證實在卵巢癌中PRC1蛋白及mRNA表達均上調，PRC1過表達導致耐藥、腫瘤復發和預后不良。本研究結果與國內外文獻[5-9]報道一致，均有力地證實PRC1可能在惡性腫瘤發生發展中發揮關鍵作用，扮演重要角色。因此進一步探討PRC1在胰腺癌發生發展中的生物學功能及機制具有一定的臨床意義。

本研究體外細胞實驗結果顯示，PRC1促進胰腺癌細胞增殖、侵襲及轉移，并抑制其凋亡。梁志剛[10]報道過表達PRC1可促進非小細胞肺癌細胞的增殖和遷移，并促進細胞周期進入分裂期，沉默PRC1則抑制非小細胞肺癌細胞的增殖和遷移。Chen et al[6]研究結果表明PRC1基因敲除顯著抑制肝癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力。本研究結果與國內外文獻[6,10]報道基本一致，均證實PRC1在胰腺癌發生發展中發揮促癌作用，為進一步的機制研究提供實驗理論基礎。

研究[11]結果表明Polo樣激酶1(Polo-like kinase 1，PLK1)是一種高度保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，與PRC1共同作用調控有絲分裂細胞周期，在腫瘤細胞的形成中發揮作用，并在多種腫瘤細胞中高表達。本研究利用STING數據庫預測PRC1通過與PLK1、KIF4A相互作用發揮功能，與文獻[11]報道一致。除此以外，還預測到與PRC1相互作用的蛋白有KIF20A、KIF11、KIF14、CDK1、TPX2、RACGAP1、CENPE、NCAPG。可為PRC1的功能研究提供新思路。

研究[12]表明抑癌基因P53是一種轉錄因子，由DNA損傷、癌基因激活和營養缺乏等多種應激信號誘導產生。具有調控細胞周期與細胞凋亡、維持基因組穩定性等多種功能，在預防腫瘤的發生中發揮關鍵作用，在功能上是“基因組的主要守護者”。Ye et al[3]報道殼聚糖包被阿霉素納米粒給藥系統通過P53/PRC1途徑促進細胞凋亡，使細胞周期停滯于G2/M期，從而抑制肝癌細胞生長。Zhang et al[4]研究結果證實PRC1直接受P53的負調控，在胃癌細胞中P53表達缺失時，PRC1則高表達。高表達的PRC1在胃癌中發揮致癌作用。研究[13]表明胰腺癌相關的基因突變多集中于Wnt信號通路、TGF-β信號通路等。Tang et al[14]研究結果表明在肝細胞癌中，microRNA-194通過PRC1介導的Wnt/β-catenin 信號通路抑制肝癌細胞侵襲和遷移。Cai et al[15]研究結果表明microRNA-194通過抑制PRC1介導的Wnt/β-catenin 信號通路來預防食道癌的發生。本研究GSEA預測PRC1在胰腺癌中發揮功能的可能信號通路有P53信號通路、Wnt信號通路等，與文獻[3-4,12-15]報道基本一致。除此以外，還預測到Notch信號通路、細胞周期、DNA復制、RNA降解、細胞凋亡、錯配修復等，可為PRC1在胰腺癌中的進一步機制研究提供更多線索和思路。

綜上所述，PRC1在胰腺癌中高表達是胰腺癌患者預后的獨立危險因素，并促進胰腺癌細胞增殖及侵襲，具有癌基因的特性，有望成為胰腺癌早期診斷和預后判斷的潛在生物學標志物。