慢性感染階段弓形蟲包囊在小鼠腦組織的動態病理變化

吳夢云，蔡 茹，李伊凡， 汪學龍，姚 湧

弓形蟲是一種專性細胞內寄生蟲，1909年由法國學者發現[1]。弓形蟲全球分布，幾乎可以在所有哺乳動物細胞中入侵并復制[2]。據估計，全球三分之一的人口被弓形蟲感染，且大多數人都處于慢性感染階段[3]。弓形蟲以“特洛伊木馬”的模式通過血腦屏障定植于大腦[4]，在慢性感染階段，弓形蟲在神經元內以包囊形式存在，形成免疫豁免[5]。寄生在中樞神經系統的弓形蟲通過基因調控宿主的神經免疫[6]，分泌效應因子和改變宿主神經信號通路[7]的途徑導致宿主腦部神經生理變化，影響宿主的精神和行為，但卻可促進自身的生命周期[8]。此前的研究[9]表明，弓形蟲對大腦特定區域具有明顯的趨向性，隨著時間的推移，包囊在宿主腦組織內的定位分布影響著宿主的精神和行為。該研究旨在動態觀察弓形蟲對宿主精神與行為的操縱與腦內包囊分布的關系，以及慢性感染階段宿主精神行為變化的內在原因。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和弓形蟲蟲株50只6～8周齡昆明種雌性小鼠，20～25 g，購于安徽醫科大學實驗動物中心，5只/籠，正常采食飲水。弓形蟲Prugniaud株(PRU株)由安徽醫科大學基礎醫學院病原生物學實驗室在昆明種鼠體內保種，傳代。

1.2 小鼠腦組織包囊的獲取在無菌條件下，頸椎脫臼處死PRU毒株弓形蟲保種小鼠，取腦組織，加生理鹽水充分研磨過濾制成含弓形蟲包囊的組織勻漿，置于5 ml EP管中保存。計數包囊后保種。

1.3 PRU株慢性感染小鼠模型的建立用含有包囊的組織勻漿制備灌胃液，調制包囊濃度為175個/ml， 經口感染50只實驗小鼠，每只小鼠灌胃35個包囊。

1.4 感染小鼠模型病情程度的動態記錄分別在小鼠感染的第10、30、40、90、120、160天觀察并記錄感染小鼠的病情變化，出現以下任一項記為1分：豎毛，弓背，活動低下，原地打轉，消化系統影響(腹脹和腹瀉)，呼吸系統影響(呼吸淺快)，中樞神經系統影響(偏癱)。

1.5 心臟灌流取感染小鼠腦組織分別在感染的第10、30、40、90、120、160天各取4只小鼠，用0.25 ml水合氯醛(80 mg/kg)注射麻醉小鼠，將生理鹽水注射器插入左心室，先灌注生理鹽水，右心耳流出的液體澄清時，立即換用4%多聚甲醛灌注20 min。待小鼠身體僵硬，內臟變白，將頭蓋骨剝開，將腦下部連接的神經剪斷，剝離完整腦組織放入有4%多聚甲醛溶液的EP管，浸沒腦組織，做標記，放入4 ℃冰箱過夜固定。取出完整大腦組織，對照小鼠解剖圖譜分離出海馬下丘腦、前額葉、紋狀體和小腦組織各4份，每份約40 mg，2份切片后用于HE染色，2份制備成2 ml組織勻漿，置于5 ml EP管中，用BX3正置顯微鏡及顯微成像系統計數包囊數量，記錄包囊直徑。

1.6 HE染色將小鼠各區域腦組織脫水后包埋，制片，切片厚度為20～40 μm。 將切片置于二甲苯中脫蠟；放入無水乙醇中；蘇木精染色10 min，用1%的鹽酸乙醇分化，加入弱堿性的促藍液；伊紅染色3 min，再進行梯度脫水；將脫水后的組織樣本切片用二甲苯浸泡2次，每次持續4 min，然后封片，使用全景組織細胞定量分析系統對切片進行拍照。

2 結果

2.1 弓形蟲PRU株慢性感染小鼠模型病情程度的動態變化弓形蟲PRU株感染小鼠從第10天開始出現感染癥狀，以豎毛、弓背和活動低下為主，少數小鼠無癥狀；在感染的第30～40天，小鼠出現大量死亡，病情評分達到峰值，存活的感染小鼠幾乎均出現豎毛弓背，活動低下，食欲不振，腹脹腹瀉，呼吸淺快，少數小鼠出現原地打轉和偏癱的癥狀；之后大部分感染小鼠病情逐漸好轉，到第90天，小鼠死亡有所減少，遺留癥狀以活力低下，弓背，毛發缺乏光澤，原地打轉和偏癱為主；在感染第120～160天，小鼠毛發恢復光澤，部分小鼠恢復正常生理狀態，遺留癥狀大部分為偏癱和原地打轉，見表1。

表1 感染小鼠病情程度變化

2.2 計數包囊個數在大腦各區域的動態分布感染鼠腦部的弓形蟲包囊在各時間節點以海馬下丘腦分布最多，前額葉和紋狀體次之，小腦最少。隨著弓形蟲感染時間遞增，在小鼠腦部各區域的弓形蟲包囊數量在30 d達頂峰，隨后包囊數量呈下降趨勢，在第90天時，包囊數量不再下降，重新開始上升，在第120天腦部各個區域的弓形蟲包囊量達到次級峰，之后數量又逐步下降。經檢驗，在弓形蟲感染的10～160天間，腦部各區域的包囊數量的差異有統計學意義(F=9.010，P<0.05)；在弓形蟲感染的各時間節點感染小鼠腦部各部位的弓形蟲數量差異有統計學意義(F=5.742，P<0.05)，見圖1。

圖1 腦部各區域弓形蟲包囊數量變化

2.3 小鼠腦部各區域弓形蟲包囊直徑的動態變化弓形蟲慢性感染期間，弓形蟲包囊在小鼠腦部各區域的直徑均隨著感染時間的增加而呈現增長趨勢，在感染小鼠海馬下丘腦、前額葉、紋狀體、小腦中弓形蟲包囊平均直徑與感染天數之間均存在相關性(R2=0.899，P<0.05；R2=0.907，P<0.05；R2=0.895，P<0.05；R2=0.888，P<0.05)；組間差異有統計學意義(t=5.965，P<0.05；t=6.243，P<0.05；t=5.833，P<0.05；t=5.637，P<0.05)，其中小鼠腦部海馬下丘腦、前額葉、紋狀體和小腦的包囊平均直徑與感染天數的相關回歸系數分別為：0.055、0.067、0.064、0.013，見圖2。

2.4 小鼠弓形蟲慢性感染腦部特異性病理動態表現觀察小鼠腦部各部位的HE染色切片發現，在感染的第40天，小鼠海馬下丘腦的弓形蟲腦炎的神經病理變化最為顯著，腦部炎癥情況也最為嚴重，可觀察到弓形蟲包囊附近小膠質細胞吞噬死亡的神經元即噬神經現象(圖3A)；弓形蟲包囊附近炎癥細胞浸潤在血管附近形成“血管袖套現象”(圖3B)；弓形蟲包囊激發的炎癥反應致使其周圍的血管發生擴張，血管周圍大量炎癥細胞浸潤(圖3C)；蛛網膜附近弓形蟲包囊導致的蛛網膜下隙大范圍出血，蛛網膜周圍浸潤的炎癥細胞以淋巴細胞和單核細胞為主(圖3D)；弓形蟲包囊在腦組織中的“衛星樣分布”(圖3E)；弓形蟲包囊附近神經膠質細胞的局限性增生(圖3F)。

圖2 腦部各區域弓形蟲包囊平均直徑變化

圖3 感染小鼠第40天腦部海馬下丘腦弓形蟲感染病理征 HE×200

圖4 慢性感染小鼠腦部特異性炎癥病理動態變化

在感染小鼠的海馬下丘腦、前額葉、紋狀體和小腦區域，弓形蟲包囊的衛星樣分布、血管袖套現象、弓形蟲包囊噬神經現象、弓形蟲包囊附近血管的擴張和膠質細胞浸潤現象的動態變化見圖4。 第10～30天，切片中開始觀察到程度較輕的腦炎癥狀且呈上升趨勢，病理表現以少數的膠質細胞局限性浸潤形成膠質結節為主，蛛網膜下隙出現的出血及炎癥細胞浸潤現象由少量上升為中等量。至感染第40天，弓形蟲腦炎病理變化最為顯著，以包囊附近的血管擴張和血管袖套現象為主，膠質細胞出現大面積浸潤及大量膠質結節的生成；蛛網膜下隙出現連續大片出血現象，較多量炎癥細胞浸潤。在感染第40～90天，腦組織中膠質細胞結節的數量大量下降；蛛網膜下隙出血逐步好轉為局限連續小面積出血及少量炎癥細胞浸潤。在感染第90～120天，以包囊附近的血管擴張現象逐漸增加為主，膠質細胞由極少數局限浸潤到少量浸潤；在第120天，弓形蟲包囊衛星樣分布的數量增加到頂峰；蛛網膜下隙出血由局限連續的小面積出血及少量炎癥細胞浸潤，至少量連續出血及中等量炎癥細胞浸潤，至感染的第160天，感染小鼠腦部炎癥病理表現逐漸恢復，僅見少量局限性膠質細胞浸潤；蛛網膜下隙幾乎不見出血，病理切片見包囊附近的蛛網膜下隙少量炎癥細胞浸潤。

3 討論

弓形蟲速殖子侵入腦組織神經元、小膠質細胞和星形膠質細胞[10]形成包囊。越來越多的證據表明，弓形蟲病的慢性感染可能會影響宿主行為且具有誘發宿主神經精神疾病的可能[11]。弓形蟲的慢性潛伏的感染可能也與精神疾病的臨床陽性癥狀的加重有關[12-13]。Hermes et al[14]研究發現，在嚙齒類動物中，弓形蟲包囊會在大腦中出現選擇性定位，從而對宿主的行為產生影響，但是對于包囊中的緩殖子通過何種機制影響宿主行為，仍有待探究。以往的研究因為弓形蟲株、動物宿主的不同以及觀測天數的局限，少有對宿主腦部包囊定位性分布與癥狀關聯性的動態研究。

本研究動態觀察弓形蟲慢性感染期間小鼠的病情變化與神經病理學變化，為了更好地監測小鼠腦部的包囊變化對于小鼠行為精神學的影響，選用成囊率較高的弓形蟲PRU株以及對弓形蟲敏感的昆明種鼠，制造弓形蟲慢性感染的動物模型。為了使弓形蟲在小鼠腦部成囊率升高，每只小鼠灌胃35個包囊，高于常規用量，這與40 d時小鼠大量死亡有關。本研究顯示，在感染的第120天，弓形蟲包囊在小鼠腦部各個部位均出現了次級峰，這與第87天發現的小鼠啃食死亡小鼠引發二次感染有關。隨著感染天數的增加，在小鼠小腦部位的包囊生長速度最快，但炎癥程度最低，這一現象提示小鼠小腦部位對弓形蟲的免疫應答低于其他部位。本研究揭示了弓形蟲慢性感染期間的病理變化與臨床表現的內在關聯，為弓形蟲包囊的定位分布對宿主精神疾病和行為影響的研究奠定了基礎。