復方乙醇手消毒液中連翹質量標準研究*

郭 婭，向春艷△，何世新，杜 彪

（1.重慶市萬州食品藥品檢驗所·三峽庫區道地藥材開發利用重慶市重點實驗室，重慶 404000；2.重慶大學附屬三峽醫院，重慶 404000）

復方乙醇手消毒液由重慶大學附屬三峽醫院開發，主要藥物連翹為木犀科植物連翹Forsythia suspensa（Thunb.）Vahl的干燥果實，有清熱解毒、消腫散結、疏散風熱功效[1］，《本草圖經》譽其為“瘡家圣藥”[2］。現代藥理學研究表明，連翹具有抑菌、抗炎、抗病毒、保肝、抗腫瘤、免疫調節和抗氧化作用[3］。近年來，國家衛生管理部門推薦以其配伍的多種中成藥預防新型冠狀病毒感染[4-5］，有一定療效。王小敏等[6］的研究結果表明，連翹果乙醇提取物抑菌活性與其中含有的多種醇類、酚類、醛類、酮類、烷烴、烯烴類物質相關，且45%～90%乙醇溶液也有抑菌作用[7］，二者聯用能進一步增強抑菌消毒作用，故可用于疫情防控期間的日常消毒。2020年版《中國藥典（一部）》中連翹含量測定項下包含連翹苷和連翹酯苷A，為快速、方便、有效地測定兩種成分含量，多采用高效液相色譜（HPLC）法、超高效液相色譜（UPLC）法及一測多評等法[8-11］。為進一步完善質量標準，本研究中采用薄層色譜（TLC）法對制劑中連翹藥材進行定性鑒別，并采用HPLC法同時測定制劑中連翹酯苷A和連翹苷含量，以建立復方乙醇手消毒液中連翹的質量標準。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260型高效液相色譜儀，含紫外檢測器（美國Agilent公司）；GC-2010plus型氣相色譜儀（日本Shimadzu公司，內含FID）；AB204S型分析天平（瑞士Mettler公司，精度為萬分之一）；ME215S型分析天平（德國Sartorius公司，精度為十萬分之一）；KQ-800DE型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

連翹酯苷A對照品（批號為111810-201606，含量93.4%）、連翹苷對照品（批號為110821-201816，含量95.1%）、連翹對照藥材（批號為120908-201817），均購自中國食品藥品檢定研究院；復方乙醇手消毒液（重慶大學附屬三峽醫院，批號分別為211013，211018，211020）；甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水；硅膠G薄層板（青島海洋化工廠）。

2 方法與結果

2.1 性狀鑒別

肉眼觀察，樣品為棕色液體；嗅之，微臭；pH試紙檢測得pH為4.5～6.0。

2.2 TLC鑒別

取樣品5 mL，水浴濃縮至干，殘渣加乙醇2 mL使溶解，作為供試品溶液。另取連翹對照藥材1 g，加石油醚（30～60℃）20 mL，密塞，超聲（功率800 W，頻率40 kHz）處理15 min，濾過，濾液濃縮至干，殘渣加乙醇2 mL，作為對照藥材溶液。按復方乙醇手消毒液處方和工藝制備缺連翹的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制成陰性對照品溶液。按2020年版《中國藥典（四部）》通則0502 TLC法試驗，吸取上述溶液各5μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以環己烷-甲酸乙酯-甲酸（15∶10∶0.25，V/V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰，分別置日光燈及紫外光燈（365 nm）下檢視[1］。供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液色譜相應位置上顯相同顏色斑點，陰性對照無干擾，詳見圖1。

圖1 連翹薄層色譜圖A.Fluorescent lamp B.Ultraviolet lamp 1.Test solution 2.Reference medicinal material solution 3.Negative reference solutionFig.1 TLC chromatograms of Forsythiae Fructus

2.3 乙醇體積分數檢查

精密量取無水乙醇適量，加N，N-二甲基甲酰胺溶解并稀釋，制成每1 mL中含乙醇8 mg的對照品溶液。另精密量取樣品適量，同法操作，得供試品溶液。精密量取上述溶液各1μL，分別注入氣相色譜儀，按2020年版《中國藥典（四部）》通則0711乙醇量測定法，色譜柱為HR-5毛細血管柱（30 m×0.32 mm，0.25μm），載氣為氮氣，流速為1.0 mL/min，進樣量1μL，分流比50∶1，進樣口溫度150℃，檢測器溫度230℃；柱溫先在50℃維持5 min，再以20℃/min的升溫速率升至150℃，維持3 min，依法進行測定，按相關規定進行精密度、穩定性、重復性試驗。結果的RSD均小于2.0%，表明儀器精密度良好，對照品溶液、供試品溶液在室溫放置24 h內基本穩定，方法重復性良好。按外標法計算峰面積，結果批號為2011013，2011018，2011020的復方乙醇手消毒液中乙醇體積分數分別為56.2%，55.8%，56.3%（均不少于50%），符合標準。詳見圖2。

圖2 氣相色譜圖1.Ethanol A.Reference solution B.Test solutionFig.2 GC chromatograms

2.4 含量測定

2.4.1 色譜條件

色譜柱：中譜紅RD-C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：0.1%磷酸溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～10 min時85%A，10～22 min時85%A→77%A；22～33 min時77%A→60%A，33～39 min時60%A）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：235 nm；柱溫：30℃；進樣量：10μL。

2.4.2 溶液制備

取連翹酯苷A、連翹苷對照品各適量，精密稱定，加50%甲醇，制得含連翹酯苷A 0.391 5 mg/mL、連翹苷0.202 4 mg/mL的單一對照品貯備液；分別精密量取上述連翹酯苷A對照品貯備液3.0 mL、連翹苷對照品貯備液1.2 mL，置同一10 mL容量瓶中，加50%甲醇定容，搖勻，即得混合對照品溶液。精密量取樣品1.0 mL，置10 mL容量瓶中，用50%甲醇溶解并定容，搖勻，濾過，取續濾液，作為供試品溶液。按復方乙醇手消毒液處方和工藝制備缺連翹的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制成陰性對照品溶液。

2.4.3 方法學考察

專屬性試驗：取2.4.2項下3種溶液，按2.4.1項下色譜條件進樣測定。結果2種被測成分分離完全，且陰性對照無干擾，表明專屬性良好。詳見圖3。

圖3 高效液相色譜圖1.Forsythoside A 2.Forsythin A.Mixed reference solution B.Test solution C.Negative reference solutionFig.3 HPLC chromatograms

線性關系考察：分別精密量取2.4.2項下連翹酯苷A對照品貯備液0.25，0.50，1.00，2.00，3.00，5.00 mL；連翹苷對照品貯備液0.10，0.20，0.40，0.80，1.20，2.00 mL，分別置10 mL容量瓶中，加50%甲醇定容，搖勻，制得系列混合對照溶液。按擬訂色譜條件進樣測定，以質量濃度（X，μg/mL）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程，連翹酯苷A為Y1=10.635 74X1+3.492 08（r=0.999 9），連翹苷為Y2=11.979 04X2-2.958 86（r=0.999 8）。結果表明，連翹酯苷A和連翹苷質量濃度分別在9.79～195.75μg/mL和2.02～40.48μg/mL范圍內與峰面積線性關系良好。

精密度試驗：取混合對照品溶液，按2.4.1項下色譜條件重復進樣測定6次，記錄峰面積。結果連翹酯苷A、連翹苷峰面積的RSD分別為0.11%和0.29%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：取樣品（批號為211013），按2.4.2項下方法制備供試品溶液，分別在室溫下放置0，2，4，8，12，24 h時，按2.4.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果連翹酯苷A、連翹苷峰面積的RSD分別為0.35%和0.68%（n=6），表明供試品溶液室溫下放置24 h內基本穩定。

重復性試驗：取同一批樣品（批號為211013），按2.4.2項下方法制備供試品溶液，按2.4.1項下色譜條件進樣測定，平行6次，記錄峰面積并計算含量。結果連翹酯苷A、連翹苷含量的RSD分別為0.11%和0.27%（n=6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：精密量取已知含量的樣品（批號為211013）6份，每份0.5 mL，分別精密加入連翹酯苷A（0.392 mg/mL）1.0 mL、連翹苷（0.202 mg/mL）0.5 mL，按2.4.2項下方法制備供試品溶液，按2.4.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算加樣回收率。結果見表1。

表1 加樣回收試驗結果（n=6）Tab.1 Results of the recovery test（n=6）

2.4.4 樣品含量測定

取3批樣品各1.0 mL，按2.4.2項下方法制備供試品溶液，按2.4.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算含量。結果批號為211013，211018，211020的樣品中，連翹酯苷A含量分別為1.580，1.557，1.572mg/mL，連翹苷分別為0.166，0.164，0.165mg/mL。

3 討論

由于連翹酯苷不穩定，高溫下易分解，有研究表明，提取溶劑的種類和濃度在連翹酯苷A和連翹苷提取工藝研究中影響較大[12-14］，故最終選擇甲醇提取。GUO等[14］及王姝君等[11］分別選用50%及70%甲醇為溶劑，結果選擇50%甲醇時，目標成分提取率較高、干擾峰少、分離度較高，且方法簡單，成本低。同時對比文獻[15-16］，參考不同方法，比較了檢測波長分別為235，275，330 nm時的結果；考察了0.1%磷酸溶液-乙腈、水-乙腈、0.4%醋酸-乙腈流動相體系；研究了0.1%，0.2%，0.4%磷酸溶液對結果的影響。結果表明，當檢測波長為235 nm，流動相為0.1%磷酸溶液-乙腈（梯度洗脫）時，色譜峰的峰形和分離度最佳。

本研究中建立的復方乙醇手消毒液質量標準結果準確可靠，配制簡單、易得、價格低，是一種可滅活病毒，殺滅腸道致病菌、化膿性球菌、致病性酵母菌及醫院感染常見細菌的速效消毒液。但本研究也存在一定局限性，雖然按2020年版《中國藥典（一部）》中連翹藥材的規定對連翹苷、連翹酯苷A進行了含量測定[1］，但連翹中含有的化學成分復雜，如綠原酸、咖啡酸、沒食子酸、阿魏酸等[17］，因此其余成分的質量標準有待進一步提升。