電子加速器輻照滅菌對肺熱普清散質量的影響*

采金金，謝和兵△，尼瑪次仁，白瑪旦增

（1.安徽中醫藥大學藥學院，安徽 合肥 230012；2.長三角藥物高等研究院，江蘇 南通 226133；3.江蘇神猴醫藥研究有限公司，江蘇 南通 226000；4.西藏神猴藥業有限責任公司，西藏 日喀則 857000）

肺熱普清散（藏藥名洛才更賽）始載于16世紀的《驗方百編》，目前收載于《中華人民共和國衛生部藥品標準·藏藥：第一冊》[1］中，為西藏神猴藥業有限責任公司獨家生產的藏藥復方制劑。該藥方主要含天竺黃、紅花、力嘎都、甘草、木香、鐵棒錘幼苗等藥材，有清肺泄熱、消炎功效，可用于小兒肺炎、流行性感冒、風熱、癘熱的治療。該方采用傳統藏藥生產工藝，藥材生藥粉碎后直接包裝為成品，按中國藥典內服散劑微生物控制的質量要求進行滅菌處理。本研究中比較了不同強度電子束輻照前后肺熱普清散性狀、顯微粉末特征、薄層色譜（TLC）鑒別、含量的變化，為該藥滅菌方法選擇提供參考依據[2-3］。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1100型高效液相色譜儀（美國Agilent公司）、XSR205DU/AC型十萬分之一天平（瑞士Mettler Toledo公司）；JA10003N型千分之一天平、UC-250DE型超聲清洗器、DHG-9030A型電熱恒溫鼓風干燥箱（上海精其儀器有限公司）；WMS-1037型生物顯微鏡（上海無陌光學儀器有限公司）；DX-10/20型電子加速器（中廣核戈瑞＜深圳＞科技有限公司）。

1.2 試藥

肺熱普清散[西藏神猴藥業有限責任公司，批號分別為20200901（樣品1），20200902（樣品2）］；羥基紅花黃色素A對照品（批號為111637-202111，含量≥96.8%）、木香烴內酯對照品（批號為111524-201911，含量≥99.9%）、去氫木香內酯對照品（批號為111525-201912，含量≥99.5%），均購自中國食品藥品檢定研究院；甲醇為色譜純，磷酸為優級純，其余試劑均為分析純，水為娃哈哈純凈水。

2 方法與結果

2.1 樣品性狀

取2批樣品各6份，采用電子加速器輻照滅菌，輻照劑量分別為0，4，6，8，10，12 kGy。通過日光下目視、口嘗、鼻嗅直觀判斷。結果，與0 kGy比較，不同劑量輻照滅菌后樣品外觀、色澤、氣味均未發生明顯變化，說明該輻照滅菌對樣品性狀無明顯影響。樣品性狀見圖1。

圖1 樣品性狀A.Sample 1 B.Sample 2Fig.1 Appearance of samples

2.2 顯微鑒別

參照2020年版《中國藥典（四部）》通則2001顯微鑒別法，取上述經輻照的2批樣品粉末過5號篩，挑取少許，滴加甘油醋酸試液，置生物顯微鏡下觀察。結果，0 kGy輻照劑量下，2批樣品花粉粒眾多，類圓形、卵圓形或橄欖形，有3個萌發孔，外壁有齒狀突起；有紅棕色或黃棕色分泌細胞（紅花）纖維梭形，單個散在的草酸鈣簇晶（力嘎都）；不同劑量輻照滅菌后，紅花和力嘎都特征均仍可見，且與0 kGy比較無明顯變化。顯微圖見圖2。

圖2 樣品顯微圖A.Sample 1 B.Sample 2Fig.2 Micrograph of samples

2.3 TLC鑒別

取上述經輻照的2批樣品5 g，加甲醇25 mL，超聲（功率250 W，頻率40 kHz；下同）處理30 min，濾過，取續濾液，作為供試品溶液。取去氫木香內酯對照品、木香烴內酯對照品，分別加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液，作為單一對照品溶液。按肺熱普清散處方及工藝制備缺木香的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制得陰性對照品溶液。參照2020年版《中國藥典（四部）》通則0502薄層色譜法，吸取上述溶液各5μL，同一批號溶液點于同一硅膠G薄層板，以環己烷-甲酸乙酯-甲酸（32∶5∶1，V/V/V）的上層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以1%香草醛硫酸乙醇溶液，加熱至斑點顯色清晰，置日光燈下檢視。結果供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應位置上均顯相同顏色斑點，陰性對照無干擾。TLC圖見圖3。

圖3 肺熱普清散薄層色譜圖A.Sample 1 B.Sample 2 1.Costunolidereferencesolution 2.Dehydrocostuslactonereferencesolution 3.Negative reference solution 4-9.Test solution（the irradiation dose is 0，4，6，8，10 and 12 kGy，respectively）Fig.3 TLC chromatograms of Feirepuqing Powder

2.4 含量測定

2.4.1 色譜條件及系統適用性試驗

色譜柱：UltimateXB-C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：甲醇-0.1%磷酸溶液（30∶70，V/V）；流速：1 mL/min；檢測波長：403 nm；柱溫：30℃；進樣量：10μL。理論板數按羥基紅花黃色素A峰計應不低于3 000，基線分離良好。

2.4.2 溶液制備

取羥基紅花黃色素A對照品適量，精密稱定，加50%甲醇制成1 mL含52μg的溶液，即得對照品溶液。取樣品粉末（過3號篩）約1.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，稱定質量，超聲處理60 min，取出，放冷，再次稱定質量，用50%甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液，即得供試品溶液。

方法學考察：按相關規定進行精密度、穩定性、重復性試驗及加樣回收試驗。結果前3個試驗結果的RSD均小于1.0%，表明儀器精密度良好，供試品溶液在室溫放置16 h內基本穩定，方法重復性良好；平均加樣回收率為100.30%，RSD為0.44%（n=6）。

含量測定：取2批樣品各6份，予相應輻照滅菌后每份樣品（過3號篩）取約1.5 g，按2.4.2項下方法制備供試品溶液，按2.4.1項下色譜條件進樣測定，記錄不同劑量輻照滅菌后2批樣品中羥基紅花黃色素A的含量。詳見表1。

表1 樣品中羥基紅花黃色素A含量測定結果（mg/g，n=2）Tab.1 Results of content determination of hydroxysafflor yellow A in the samples（mg/g，n=2）

2.5 微生物檢查

按2015年版《中國藥典（四部）》通則中無菌產品微生物限度檢查相關規定[包括通則1105（微生物計數法）、通則1106（控制菌檢查法）及通則1107（非無菌藥品微生物限度標準）］，檢查樣品細菌菌落總數、霉菌酵母菌菌落總數、大腸菌群菌落總數。與0 kGy比較，經不同劑量輻照后，2批樣品細菌菌落總數、霉菌酵母菌菌落總數均顯著減少（P＜0.05）。輻照劑量為4 kGy時，霉菌及酵母菌均已無法檢出；為8 kGy時，霉菌、酵母菌及細菌菌落均未檢出。大腸菌群一直未檢出。結果見表2。

表2 樣品微生物限度檢查結果（n=2）Tab.2 Microbial limit test results of samples（n=2）

3 討論

藏藥遵循傳統藏醫藥理論，多以原生藥粉直接入藥制成丸劑、散劑，整個過程中無高溫蒸煮等工序，致使生產中無法精準控制微生物，導致藏成藥微生物限度很難達到《中國藥典》標準，嚴重限制了傳統藏藥產品的臨床應用[4-7］。

目前中藥常用的滅菌方法有濕熱滅菌法、干熱滅菌法、微波滅菌法等[8-18］，但均因會導致生藥藥粉色澤變深、揮發性成分逸散而不適用于肺熱普清散。電子加速器輻照滅菌利用電子加速器產生的高能電子束照射物質達到滅菌目的，相較傳統的濕熱、干熱、紫外滅菌等，最大優勢為屬冷滅菌，穿透性更高、更環保，更適用于含生藥材粉及揮發性成分較多的藏成藥的滅菌。此外，電子加速器輻照還具有輻照束流定向、能量利用充分、效率高和不產生放射性廢物等優點[19-25］，是國家大力鼓勵發展的新興產業。隨著電子加速器制造技術的不斷進步，電子加速器輻照在中藥、食品滅菌領域得以廣泛使用，但對傳統含有藏藥材生藥粉的藏成藥的輻照滅菌研究仍較少。

2015年11月，原國家食品藥品監督管理總局《中藥輻照滅菌技術指導原則》要求，采用輻照滅菌必須遵循“必要、科學、合理、安全、有效、穩定”原則。本研究中在綜合分析基礎上確定擬采用的最大輻照劑量，以確保中藥的安全、有效、質量穩定[26-32］。

綜上所述，本研究中建立的各檢測方法，可為藏藥肺熱普清散的輻照滅菌提供參考，也為部分藏成藥滅菌方案的選擇提供新思路。