基于蛋白酶活力的地龍酒制工藝優選*

周廣濤，黃蒙蒙，解盈盈，汪 冰，林永強△

（1.山東省食品藥品檢驗研究院·國家藥品監督管理局膠類產品質量評價重點實驗室·山東省中藥標準創新與質量評價工程實驗室，山東 濟南 250101；2.山東宏濟堂制藥集團股份有限公司，山東 濟南 250000）

地龍為鉅蚓科動物參環毛蚓Pheretima aspergillum（E.Perrier）、通俗環毛蚓Pheretima vulgarisChen、威廉環毛蚓Pheretima guillelmi（Michaelsen）或櫛盲環毛蚓PheretimapectiniferaMichaelsen的干燥體（前1種習稱“廣地龍”，后3種習稱“滬地龍”）[1］。地龍廣泛應用于各類溶栓制劑，但因腥味較濃，常通過炮制（最常使用酒制）祛臭矯味[2］。目前，酒地龍多收載于各省（區、市）地方標準中，但其標準較簡單，無法有效控制飲片的質量。有研究表明，地龍中抗栓主要活性成分為蚯蚓纖溶酶[3-10］，過度受熱和加入過量乙醇可能影響酶活力，進而影響飲片的藥效。因此，可通過測定酶活力，對炮制條件、工藝參數加以控制，以祛臭矯味且保證藥效。本研究中采用水提法[11］提取蚯蚓纖溶酶，L9（34）正交試驗法對加酒量、炮制溫度、炮制時間和燜潤時間4個影響因素進行考察，并采用纖維蛋白平板法[12-13］測定酒制品的酶活力，確定最優炮制工藝。現報道如下。

1 材料

1.1 儀器與試藥

儀器：Sartorius CP225D型電子天平（賽多利斯科學儀器有限公司）；Climacell222型恒溫恒濕箱（德國MMM集團）；玻璃培養皿（定制，10 cm×10 cm）；KQ-500DE型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；V14r pro型臺式高速離心機（生命動力亞洲Dynamica有限公司）。

試藥：纖維蛋白原、纖維蛋白溶酶原、凝血酶（均來自牛血，中國食品藥品檢定研究院，批號分別為140607-202042，140606-201826，140605-201927）；磷酸二氫鈉、氯化鈉、鹽酸（國藥集團化學試劑有限公司，批號分別為20190415，20180111，20190729）；黃酒（浙江古越龍山紹興酒股份有限公司，批號為20211006）；水為純化水。地龍（市場購買），經我院汪冰副主任藥師鑒定為鉅蚓科動物參環毛蚓Pheretima aspergillum（E.Perrier）的干燥體。

2 方法與結果

2.1 纖維蛋白板制備

取瓊脂糖100 mg，加磷酸鹽緩沖液（PBS；取磷酸氫二鈉21.4 g，氯化鈉5.26 g，加水900 mL，用1 mol/L鹽酸調pH至7.8，再加水至1 000 mL，即得；下同）8 mL，加熱使溶解，制成瓊脂糖溶液，置55℃水浴中恒溫待用。分別取纖維蛋白原、纖維蛋白溶酶原、凝血酶加PBS制成每毫升分別含3.5，1，10個單位的溶液，分別精密量取6，1，1 mL，依次加入上述瓊脂糖溶液中，混勻，迅速倒入水平放置的培養皿中，待其凝固后，蓋上蓋，于4℃保存1 h，取出，在纖維蛋白凝固層上打若干個直徑約3 mm小孔，即得纖維蛋白板。

2.2 酶活力計算

以單位質量樣品溶圈面積計算蚯蚓纖溶酶活力[14］。公式如下：總活力=(π×r2)/(G×V)×定容體積，式中，r為溶圈半徑（mm），G為取樣量（g），V為點樣量（mL）。

2.3 水提條件考察

提取方式：取藥材樣品粉末（過3號篩）0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加水25 mL，稱定質量。分別以超聲（功率250 W，頻率50 kHz）處理3 h、靜置提取16 h、振蕩（頻率120 r/min，下同）提取16 h。取出，放冷，再次稱定質量，用水補足減失的質量，6 000 r/min離心10 min，取上清液，即得供試品溶液。各精密量取10μL，注入纖維蛋白板孔中，37℃恒溫保持18 h后，測量溶圈半徑。結果，超聲法提取時無溶圈；恒溫振蕩和靜置提取時的溶圈半徑分別為4 mm和2.5 mm。故確定以振蕩提取。

提取溫度：同“提取方式”項下方法處理藥材樣品，加水，稱定質量。分別置30℃、40℃、50℃恒溫振蕩提取16 h。取出，放冷，再次稱定質量，用水補足減失的質量，6 000 r/min離心10 min，取上清液，即得供試品溶液。各精密量取10μL，注入纖維蛋白板孔中，37℃恒溫保持18 h后，測量溶圈半徑。結果，30℃、40℃、50℃提取時的溶圈半徑分別為2.5 mm、4 mm和3 mm。故確定提取溫度為40℃。

提取時間：同“提取方式”項下方法處理藥材樣品，加水，稱定質量。分別置40℃恒溫振蕩提取14 h、16 h、18 h。取出，放冷，再次稱定質量，用水補足減失的質量。6 000 r/min離心10 min，取上清液，即得供試品溶液。各精密量取10μL，注入纖維蛋白板孔中，37℃恒溫保持18 h后，測量溶圈半徑。結果，14 h（2.5 mm）時最小，16 h（3.5 mm）和18 h（3.25 mm）時結果基本無差異。故確定提取16 h。

2.4 正交試驗

以炮制溫度（因素A）、炮制時間（因素B）、加酒量（藥材量以100 g計，因素C）和燜潤時間（因素D）為考察因素（因素與水平見表1），各炮制品的酶活力為評價指標，采用L9（34）正交試驗法（試驗設計與結果見表2，方差分析結果見表3）優選地龍酒制工藝。結果顯示，各因素對測定結果影響順序為A＞B＞D＞C，最佳酒制工藝為A1B2C2D2。以極值最小的因素C為誤差項進行方差分析，結果因素A對提取工藝有極顯著影響（P＜0.01），因素B有顯著影響（P＜0.05）。綜合考慮成本并參考《安徽省中藥飲片炮制規范》（2019年版）、《四川省中藥飲片炮制規范》（2015年版）、《貴州省中藥飲片炮制規范》（2005年版），確定最佳酒制工藝為A1B2C2D2，即每100 kg地龍，加黃酒12.5 kg拌勻，燜潤30 min，70℃翻炒2 min。

表1 因素與水平Tab.1 Factors and their levels

表2 L 9（34）正交試驗設計與結果Tab.2 Design and results of the L9（34）orthogonal test

表3 方差分析結果Tab.3 Results of the ANOVA

2.5 驗證試驗

取炮制藥材（每100 kg地龍、加黃酒12.5 kg拌勻，燜潤30 min，70℃翻炒2 min）樣品粉末（過3號篩）約0.5 g，共6份，精密稱定，按振蕩法提取，40℃提取16 h，精密量取供試品溶液10μL，注入纖維蛋白板孔中，37℃恒溫保持18 h后，測量溶圈半徑，計算酶活力。結果見表4及圖1。

圖1 驗證試驗結果Fig.1 Results of the verification test

表4 驗證試驗結果（n=6）Tab.4 Results of the validation test（n=6）

3 討論

地龍作為臨床活血通絡常用藥，其質量控制多集中在性狀鑒別及氨基酸鑒別方面，但對其活血通絡的主要有效成分蚯蚓纖溶酶、蚓激酶等蛋白酶的報道較少[15］。本研究中發現，不同的工藝參數對蛋白酶活性影響較大，這可能與酶受熱易變性失活有關，提示炮制過程中應注意炮制溫度和翻炒時間，避免對其中的活性成分造成過度破壞，從而影響藥效。另有報道顯示，酒制地龍較生品地龍在止咳、平喘方面療效有增強，與其中的次黃嘌呤受熱含量增加有關[16］，提示在地龍酒制過程中，除保證蛋白酶活性外，還應考慮炮制品的具體用藥方向。

總之，地龍的炮制在注意除臭矯味的同時，還需注意有效成分的保護、轉化。本研究中采用水提法、正交試驗法、纖維蛋白平板法，對炮制品的酶活力進行測定，可對地龍的酒制工藝進行優化，有助于保留其有效成分。