白芍總苷對系統性紅斑狼瘡模型大鼠Trap1基因多態性與維生素D代謝的影響*

黃美瓊，邢飴喜，梁 金，陳維飛，劉 贊

（海南醫學院第二附屬醫院風濕科，海南 海口 570311）

系統性紅斑狼瘡（SLE）為多發于女性的免疫功能異常性疾病，其發病機制尚未明晰[1］。目前臨床多采用糖皮質激素+免疫抑制劑治療，但長期使用會導致免疫力低下、向心性肥胖，甚至精神異常[2］。白芍總苷對自身免疫缺陷疾病有一定防治作用，其具有抑制活性氧自由基形成及清除多余自由基的作用，可通過發揮抗凋亡、抗氧化及抗炎等作用保護機體器官[3］。近年來研究發現，從中藥白芍根部提取的白芍總苷，具有調節機體神經及免疫的作用[4］，SLE患者使用后預后較好[5］。腫瘤壞死因子受體相關蛋白1（TRAP1）為線粒體伴侶蛋白，其基因位于16號染色體（16p13.3區域），是熱休克蛋白90（HSP90）家族的新成員。TRAP1可通過折疊、重折疊受損蛋白等機制保護細胞免受氧化應激等損傷，被認為是細胞氧化應激系統的關鍵成分。染色體16p13區域內存在和自身免疫性疾病發病有關的基因，如KIAA0350和MEFV基因[6］。TRAP1基因的過表達也被認為與多藥耐藥性有關[7］。研究表明，TRAP1在乳腺癌、結直腸癌等腫瘤中表達上調，但對其在免疫性疾病中的作用并無報道[8］。維生素D缺乏被認為是SLE的病因[9］，但尚無白芍總苷與其相關性的報道。本研究旨在探討白芍總苷可否通過調控核因子κB（NF-κB）信號通路對SLE大鼠Trap1基因多態性與維生素D代謝產生影響，進而研究其對SLE的療效。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥與動物

儀器：Thermo Histocentre3型全自動組織包埋機（美國Thermo公司）；HH34000000全波長酶標儀（上海瑋馳儀器有限公司）；Leica-RM2135型高級組織切片機（德國Leica公司）；ABI7500定量PCR儀（美國Applied Biosystems公司）；Cabas E601型全自動電化學發光免疫分析儀（德國Roche公司）。

試藥：白芍藥材（亳州市滬譙藥業有限公司，批號17052594）；25（OH）D、1，25（OH）2D3試劑盒（深圳海思安生物技術有限公司，批號分別為20210196，20211021）；兔抗大鼠一抗NF-κB及辣根過氧化物酶標記（HRP）的山羊抗兔二抗（英國Abcam公司，批號分別為20210289，20211062）；mRNA反轉錄試劑盒和實時熒光定量聚合酶鏈式反應（qPCR）試劑盒（寶生物工程有限公司，批號分別為20210345，20210632）；RIPA裂解液（北京索萊寶生物技術公司，批號為SL059234）。

動物：SD大鼠50只，健康，雄性，體質量180～200 g，6～8周齡。由安徽醫科大學實驗動物中心提供，實驗動物生產許可證號SCXK（皖）2017-001，該實驗經我院動物實驗醫學倫理委員會批準（批準號202005010）。所有大鼠均置溫度21～23℃、相對濕度40%～70%的實驗條件下適應性喂養1周。

1.2 方法

1.2.1 白芍總苷制備

將白芍藥材與親水性溶液攪拌，50～90℃提取3次，合并濾液、濾過，將其通過減壓回收制成干燥的粗提取物；采用親水性溶液溶解，過濾成水溶液；采用大孔吸附樹脂進行吸附、純化；再次洗脫減壓，制成白芍總苷提取物。

1.2.2 建模與分組

將50只SD大鼠隨機分為空白組（等體積生理鹽水）、模型組（等體積生理鹽水）及白芍總苷低、中、高劑量組（0.5，1，5 g/mL），各10只。空白組大鼠單次腹腔注射生理鹽水每10 g體質量0.2 mL，其余各組大鼠均注射降植烷，每只0.5 mL，每周1次，連續3周。以大鼠尿蛋白質量濃度介于0.1～1.0 g/L為模型復制成功。建模成功后，白芍總苷各劑量組分別灌胃給予相應劑量白芍總苷，每日1次，連續28周。

1.2.3 檢測指標

尿蛋白水平：初始給藥后每月1次提尾刺激大鼠排尿，收集尿液，浸濕Albustix檢測試紙反應區，觀察試紙顏色與色板比較，根據顯色度分為-，±，+，++，+++，++++。

腎臟組織病理形態：給藥結束后，頸椎脫臼處死大鼠，解剖觀察腎臟有無肉眼可見病變，病變組織制成石蠟切片，蘇木素-伊紅（HE）染色，顯微鏡下觀察組織病變。

血清學指標及蛋白表達水平：大鼠麻醉后從眼底靜脈叢取血，肝素抗凝，3 000 r/min離心10 min，分離得血清，采用電化學發光免疫法測定25（OH）D及1，25（OH）2D3水平，嚴格按試劑盒說明書要求操作；提取血清總RNA，按反轉錄試劑盒說明書要求，將總RNA反轉錄成cDNA，然后以GAPDH為內參進行擴增，檢測NF-κB的mRNA相對表達量：ΔCt=目的基因Ct-內參基因Ct，引物序列見表1；采用Western blot法檢測大鼠NF-κB蛋白表達水平。提取血清總蛋白，測定濃度，然后上樣、電泳、轉膜后，以牛血清白蛋白（BSA）封閉2 h，洗膜，孵育過夜，再加入一抗、二抗孵育，再次洗膜，顯色，5min后凝膠成像，采集圖片。

1.2.4Trap1基因型檢測

引物序列見表1，PCR反應總體積25μL，反應程序為：94℃預變性5 min，94℃變性30 s，60℃或62℃退火30 s，72℃延伸30 s，35個循環；72℃延伸10 min，4℃保存。將PCR產物進行電泳，進行單鏈構象多態性（SSCP）分析，取PCR產物與Loading buffer混勻，變性后再次電泳、顯色。根據NCBI網站已知的大鼠單核苷酸多態性（SNP）基因庫可確定突變位點，此處將G/G定義為AA基因型，G/A定義為AB基因型，A/A定位為BB基因型。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

1.3 統計學處理

采用SPSS 23.0統計學軟件分析。計量資料以±s表示，多組間比較行方差分析；計數資料以率（%）表示，行χ2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 尿蛋白水平

與模型組比較，白芍總苷中、高劑量組大鼠尿蛋白陽性例數較少，且隨著劑量的增加而減少（P＜0.05），見表2。

表2 各組大鼠尿蛋白水平比較（例，n=10）Tab.2 Comparison of urinary protein levels of rats in each group（case，n=10）

2.2 腎臟組織病理形態

與空白組比較，模型組大鼠腎臟出現毛細血管增生，腎小球腫大，血管周圍有炎性細胞浸潤；與模型組比較，白芍總苷低、中、高劑量組腎纖維化與炎性程度減少，且中、高劑量組改善更明顯，詳見圖1。

圖1 大鼠腎臟組織病理形態（HE，×40）A.Blank group B.Model group C.TGP low-dose group D.TGP medium-dose group E.TGP high-dose groupFig.1 Histopathological morphology of rats′kidney（HE，×40）

2.3 血清學指標

與模型組比較，白芍總苷低、中、高劑量組25（OH）D、1，25（OH）2D3水平均明顯升高，NF-κB mRNA及其蛋白表達水平均明顯降低（P＜0.05）。詳見表3及圖2。

表3 各組大鼠血清學指標比較（±s，n=10）Tab.3 Comparison of serological indexes of rats in each group（±s，n=10）

表3 各組大鼠血清學指標比較（±s，n=10）Tab.3 Comparison of serological indexes of rats in each group（±s，n=10）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。Note：Compared with those in the blank group，*P＜0.05；Compared with those in the model group，#P＜0.05.

組別空白組模型組白芍總苷低劑量組白芍總苷中劑量組白芍總苷高劑量組F值P值25（OH）D（ng/mL）40.23±8.24 13.08±5.69*19.36±2.28#27.37±2.41#35.18±2.17#53.252＜0.001 1，25（OH）2D3（pmol/L）92.18±11.39 42.36±8.74*55.29±6.14#61.47±5.08#79.24±4.36#67.313＜0.001 NF-κB 0.78±0.08 1.79±0.09*1.61±0.05#1.42±0.06#1.25±0.04#346.203＜0.001 NF-κBmRNA 0.81±0.05 1.82±0.04*1.64±0.09#1.45±0.07#1.26±0.03#427.591＜0.001

圖2 大鼠NF-κB蛋白表達Fig.2 Expression levels of NF-κB protein in rats

2.4 Trap1基因型分布

各組大鼠中AA，AB，BB基因型分布情況基本一致，且AB，BB型分布差異無統計學意義（P＞0.05）。詳見表4。

表4 各組大鼠基因型分布情況[例（%），n=10］Tab.4 Distribution of rats′genotypes in each group[case（%），n=10］

3 討論

SLE屬自身免疫性疾病，突出表現為皮膚黏膜、骨骼肌肉、腎及中樞神經系統等多個器官和系統出現免疫性炎癥[6］。有關該病的發病機制與治療方法是目前的研究熱點，糖皮質激素和免疫抑制劑長期或大量使用，易引發或加重感染及潰瘍性疾病，并增加高血壓、動脈硬化等并發癥的發生風險[9-10］。作為潛在的環境因素，機體的維生素D水平對機體免疫力影響極大。而維生素D在SLE患者體內的作用機制可能是由可旁分泌的樹突狀細胞產生了1，25（OH）2D3，進而影響血清中的細胞因子聚集來減少SLE患者的免疫[11-12］。TRAP1是參與癌細胞中能量代謝調節的分子伴侶，可調節癌細胞代謝，對癌基因和腫瘤抑制因子具有雙重作用[13］。還有研究指出，NF-κB通路在免疫物質發生特異性免疫效應過程中起重要作用，同樣也參與調節特異性抗原產生特異性的細胞免疫或體液免疫過程，指出NF-κB與炎癥免疫反應有關[14］。并且白芍總苷可調控NF-κB信號通路，對炎性疾病具有一定的治療作用。但其機制還不夠明確，且對于SLE的療效也無具體研究驗證。

本研究結果顯示，白芍總苷灌胃后，尿蛋白呈陽性的大鼠例數減少，這說明，其對SLE大鼠有一定的療效。腎臟組織病理結果進一步明確，白芍總苷對SLE有較好的療效，有利于改善器官病變。活性維生素D能抑制淋巴細胞的異常增殖活動，影響淋巴細胞的分化程度，從而影響機體的免疫調節[15］。1，25（OH）2D3可通過抑制機體內白細胞介素的產生和炎性細胞的活性來有效阻止機體樹突狀細胞的分化，如分泌不足就會導致血清維生素D代謝不足，與SLE發生發展有密不可分的關系[16］。本研究結果顯示，白芍總苷各劑量組25（OH）D、1，25（OH）2D3水平較模型組升高，說明其能影響維生素D的代謝，可提升維生素D水平，從而緩解病情。王醫林等[17］發現，SLE患者外周血中25（OH）D水平與免疫系統內功能最重要的細胞群相關，其可能是通過調節這一細胞群來治療SLE，這與本研究結果有一定的相通之處。

檢測不同組大鼠中Trap1基因型的分布情況發現，其整體分布并無波動，因此認為，白芍總苷對大鼠模型的Trap1基因多態性影響不明顯。NF-κB在大量研究中被證實與SLE的發生相關。本研究結果顯示，與模型組比較，白芍總苷各劑量組NF-κB蛋白及mRMA表達水平較低，提示其可調控NF-κB信號通路。潘冠和等[18］研究發現，NF-κB功能異常可顯著影響SLE的發生，還指出，其活化異常可能與皮損、狼瘡腎炎有關，并提及NF-κB參與調節輔助性T細胞17（Th17）的分化，而Th17細胞在SLE疾病的發生發展中也發揮著一定作用，進一步佐證了本研究結果。

綜上所述，白芍總苷對模型大鼠SLE有一定療效，機制可能為通過抑制NF-κB通路的活化改善大鼠體內維生素D代謝不足，這對SLE的臨床治療有一定的參考價值。