兒童急性淋巴細胞白血病中E-鈣黏蛋白甲基化對預后的影響

齊鳳旗 韓偉 顏靜 辛聰 李艷 郭雷 王文鵬 高吉照

（徐州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院兒科血液與腫瘤病區(qū)，江蘇徐州 221002）

急性淋巴細胞白血病（acute lymphoblastic leukemia，ALL）是兒童最常見的惡性腫瘤，近年來發(fā)病率呈逐步上升趨勢[1]。ALL的發(fā)生是多基因、多階段變異累積形成的病理過程，抑癌基因功能失活是關(guān)鍵機制之一[2]；細胞間黏附分子的丟失和/或功能缺失則導致腫瘤轉(zhuǎn)移[3]。抑癌基因和細胞間黏附分子功能可通過多種途徑失活，如基因突變、丟失及DNA甲基化修飾等[2-3]。E-鈣黏蛋白（E-cadherin）是一種鈣依賴性細胞間黏附分子和腫瘤抑制蛋白，與多種惡性腫瘤如乳腺癌、甲狀腺癌、結(jié)直腸癌等的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[4-6]，E-cadherin基因在兒童ALL中存在高度甲基化[7]，但其甲基化狀態(tài)對兒童ALL預后的影響未見報道。本研究旨在探討E-cadherin表達及其基因甲基化狀態(tài)對兒童ALL預后的影響。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取徐州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院兒科血液與腫瘤病區(qū)2018年5月—2022年1月首次確診的ALL患兒作為研究對象。納入標準：（1）根據(jù)《兒童急性淋巴細胞白血病診療建議（第四次修訂）》[8]的ALL診斷、治療和療效評判標準首次確診的ALL，年齡0～16歲；（2）第33天患兒骨髓均達完全緩解；（3）正規(guī)治療至隨訪結(jié)束者。排除標準：（1）伴有其他惡性疾病及自身免疫病；（2）確診前使用激素及其他免疫抑制劑；（3）至隨訪終止前放棄治療、轉(zhuǎn)外院及失訪者；（4）不同意入組者。入組患兒根據(jù)確診時及誘導化療第33天分為治療前組和治療后組。本研究獲徐州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院倫理委員會批準，批準號：XYFY2022-KL089。

1.2 治療方案

采用《兒童急性淋巴細胞白血病診療建議（第四次修訂）》[8]方案即中國兒童白血病協(xié)作組（Chinese Children's Leukemia Group，CCLG） 急性淋巴細胞白血病2008（CCLG-ALL-2008）方案化療，VDLP方案誘導緩解治療：V為長春地辛；D為柔紅霉素；L為培門冬酶替代左旋門冬酰胺酶；P-地塞米松代替醋酸潑尼松。

1.3 主要試劑與儀器

淋巴細胞分離液（MP Biomedicals公司，美國），紅細胞裂解液（上海碧云天生物科技有限公司，中國）TRIzol（Invitrogen公司，美國），cDNA第一鏈合成試劑盒、SYBR Green、18-T Vector（TaKaRa公司，日本），亞硫酸氫鹽處理試劑盒（Promega公司，美國），PCR引物、BCA蛋白含量檢測試劑盒、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、Rabbit Anti-GAPDH、Rabbit Anti-E-cadherin、羊抗兔IgGHRP、全蛋白提取試劑盒、Western Blotting檢測試劑盒（江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司，中國），PCR純化試劑盒、細胞基因組DNA提取試劑盒、DNA純化試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司，中國]。普通梯度PCR儀、熒光定量PCR循環(huán)儀（ABI公司，美國），移液器（Eppendorf公司，德國），電泳儀、Trans-Blot Turbo全能型蛋白轉(zhuǎn)印系統(tǒng)、凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad公司，美國）。

1.4 標本制備

采集化療前及誘導化療第33天患兒骨髓血5 mL，EDTA抗凝，密度梯度離心法分離骨髓單個核細胞，PBS液洗滌3次，將單個核細胞移至EP管，-80℃冰箱凍存。

1.5 RT-qPCR檢測E-cadherin mRNA的表達

按照TRIzol說明書提取單個核細胞總RNA；參照cDNA第一鏈合成試劑盒說明書合成cDNA；E-cadherin上游引物：5'-TACCCTGGTGGTTCAAGCTG-3'，下游引物5'-CAAAATCCAAGCCCGTGGTG-3'，片段長度128 bp，GAPDH上游引物 5'-AGATCATCAGCAATGCCTCCT-3'，下游引物5'-TGAGTCCTTCCACGATACCAA-3'，片段長度90 bp，將2×Realtime PCR Master Mix （SYBR Green） 10 μL、1 μL 模板 （cDNA 稀釋 10倍）、2 μL 引物 （上 下游引物各為 10 μmol/L）、7 μL 0.1%DEPC水和20 μL Total volume依次加入0.1 ml PCR管，95℃預變性5 min，95℃變性15 s，60℃退火20 s，72℃延伸40 s，共40個循環(huán)；95℃變性15 s，驟冷至60℃。制作溶解曲線，采用相對定量法（2-△△C）t對結(jié)果進行比較分析。

1.6 Western blot檢測E-cadherin 蛋白表達

PBS液洗滌2次骨髓單個核細胞，加入Lysis Buffer裂解液，冰上裂解20 min，4℃ 12 000 r/min離心5 min，取上清，取200 μg行10%SDS-PAGE電泳，電泳條件：電壓60 V，蛋白進入分離膠后，提高到90 V；轉(zhuǎn)膜，TBST洗膜5 min×3次；置入含一抗（1∶10 000稀釋）平皿中，4℃搖床振蕩孵育過夜，次日室溫振蕩30 min，棄一抗，TBST洗膜10 min×3次，加二抗（1∶10 000稀釋），室溫搖床振蕩反應(yīng)2 h，棄二抗，TBST洗膜5 min×3次。ChemiDoc MP Imaging System成像，Gel-Pro32軟件灰度分析，蛋白相對表達量采取灰度值/內(nèi)參獲得。

1.7 甲基化特異性PCR法檢測E-cadherin基因甲基化

按照DNA提取試劑盒提取DNA；純化，乙醇沉淀和重懸。PCR擴增體系30 μL：上下游引物（10 μmol/L） 各 1 μL，DNA 2 μL， dNTP 1 μL，10×PCR reaction buffer 3 μL， Taq 酶 1 μL， H2O 21 μL。E-cadherin基因甲基化特異性上游引物5'-GGGTTATCGCGTTTATGC-3'，下游引物5'-CCCCGTACCGCTAATTAAC-3'，擴增產(chǎn)物 120 bp；非甲基化特異性上游引物5'-AGAGGGTTATTGTGTTTATGT-3'，下游引物5'-CCCCCCATACCACTAATTAACT-3'，擴增產(chǎn)物120 bp。擴增條件：95℃預變性10 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸40 s，循環(huán)40次；72℃延伸5 min；1%瓊脂糖凝膠電泳。電泳條件：電壓100 V，時間25 min；凝膠成像系統(tǒng)拍照保存。甲基化判定：甲基化特異性引物擴增陽性，即為甲基化陽性；若甲基化特異性引物擴增陰性，需非甲基化特異性引物同時擴增陽性才可判斷為甲基化陰性。

1.8 隨訪

入組患兒隨訪至2022年6月30日，隨訪內(nèi)容：微小殘留、骨髓細胞形態(tài)學、初診時異常分子/遺傳學結(jié)果、骨髓/髓外復發(fā)及處理、死亡。

1.9 統(tǒng)計學分析

使用IBM SPSS 26.0 統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。計量資料呈正態(tài)分布以均數(shù)±標準差（±s）表示，治療前與治療后比較采用配對t檢驗；計數(shù)資料比較使用χ2檢驗；生存分析采用Kaplan-Meier法，組間總生存（overall survival，OS）率和無事件生存（event-free survival，EFS）率比較采用log-rank檢驗。以α=0.05為檢驗水準。

2 結(jié)果

2.1 一般資料

共納入ALL患兒42例，其中男性23例，女性19例，年齡8.6個月至13歲，中位年齡5.54歲。42例患兒中骨髓幼稚細胞最高95%，最低31%，平均76%，B原始淋巴細胞的白血病38例（90%），T淋巴細胞白血病4例（10%），染色體核型異常14例（33%），正常25例（60%），未見分裂相3例（7%），融合基因陽性24例（57%），基因突變10例（24%）。

2.2 兩組E-cadherin mRNA和蛋白的表達

治療后組E-cadherin mRNA和蛋白的相對表達高于治療前組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表1、圖1。

表1 兩組E-cadherin mRNA和蛋白的相對表達 （±s）

表1 兩組E-cadherin mRNA和蛋白的相對表達 （±s）

圖1 治療前和治療后組E-cadherin蛋白表達電泳1～3為治療前組；4～6為治療后組。

2.3 兩組E-cadherin 基因甲基化狀態(tài)

治療后13例E-cadherin基因甲基化陽性患兒轉(zhuǎn)陰，治療后組E-cadherin基因甲基化狀態(tài)陽性率較治療前組下降，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表2、圖2。

表2 兩組E-cadherin基因甲基化陽性率

圖2 治療前和治療后組E-cadherin 基因甲基化圖1～2為治療前組；3～4為治療后組；M示甲基化陽性，U示甲基化陰性。

2.4 隨訪結(jié)果

隨訪至2022年6月30日或死亡發(fā)生時間。42例患兒中復發(fā)3例，其中2例為骨髓復發(fā)，1例為髓外復發(fā)（中樞神經(jīng)系統(tǒng)白血病）；死亡4例，均為甲基化陽性者。甲基化陰性者OS率和EFS率均高于甲基化陽性者，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=3.927，P=0.0475；χ2=4.013，P=0.045），見圖3～4。

圖3 甲基化陰性者總體生存率高于甲基化陽性者

圖4 甲基化陰性者無事件生存率高于甲基化陽性者

3 討論

E-cadherin是胞外域、跨膜域和胞內(nèi)域構(gòu)成的跨膜糖蛋白，由CDH1基因編碼，是鈣黏蛋白家族中的一員，屬于Ⅰ類經(jīng)典鈣黏蛋白[9]。E-cadherin與β-catenin形成復合物，錨定于肌動蛋白細胞骨架上，使細胞穩(wěn)定連接[3]，維持細胞黏附和上皮結(jié)構(gòu)完整，成為調(diào)節(jié)上皮-間充質(zhì)的關(guān)鍵標志物[10]。在結(jié)直腸癌、胃癌、甲狀腺癌、乳腺癌等疾病中E-cadherin可通過影響上皮間充質(zhì)的轉(zhuǎn)化發(fā)揮抑制腫瘤細胞的作用[4-6，11]，且與腫瘤的TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、囊外浸潤等相關(guān)[10]。本研究顯示，治療后E-cadherin mRNA和蛋白表達水平高于治療前，我們考慮化療可抑制E-cadherin基因甲基化，使其正常表達，抑制白血病細胞的遷移和浸潤。本試驗前期研究已驗證E-cadherin的表達與外周血白細胞計數(shù)的多少、骨髓及外周血原幼稚細胞比例無明顯相關(guān)性[12]，不排除分子生物學方面影響E-cadherin的表達，影響兒童ALL的預后。同時，E-cadherin的低表達使E-cadherin/β-catenin復合物減少，大量β-catenin積累在細胞質(zhì)并進入細胞核，激活信號通路[13-14]，參與兒童ALL的發(fā)展。

DNA甲基化是影響基因轉(zhuǎn)錄和表達的主要表觀遺傳修飾，腫瘤抑制基因啟動子和增強子區(qū)域中胞嘧啶鳥嘌呤二核苷酸（cytidine phosphate guanosine，CpG）的高甲基化是腫瘤發(fā)生、癌細胞存活及侵襲性增強的重要機制[15]。一些癌相關(guān)基因啟動子的甲基化與基因失活有關(guān)如E-cadherin、P16等，是許多腫瘤發(fā)生早期事件的關(guān)鍵因素[16]。DNA甲基化可致基因突變、染色體異常等，影響腫瘤進展和預后[17]。本實驗發(fā)現(xiàn)誘導治療后13例E-cadherin基因甲基化陽性患兒轉(zhuǎn)陰，我們認為誘導化療后達到完全緩解，一方面白血病細胞被大量殺滅，高甲基化細胞大量減少；另一方面，不排除誘導方案中有能使E-cadherin基因去甲基化的藥物。有研究[18]報道柔紅霉素聯(lián)合地西他濱比單用地西他濱使DNA去甲基化效果好，故誘導治療后，部分患兒E-cadherin基因甲基化由陽性轉(zhuǎn)為陰性。

生存分析顯示E-cadherin基因甲基化陰性患兒OS率和EFS率高于甲基化陽性患兒，DNA甲基化導致E-cadherin沉默，功能喪失，使白血病細胞增殖、增加侵襲力[19]，致使化療效果不理想導致復發(fā)甚至死亡。因此我們認為，E-cadherin基因甲基化狀態(tài)是影響兒童ALL治療效果及預后的因素之一。治療前或?qū)χ委熜Ч患训幕純海瑱z測其E-cadherin基因甲基化狀態(tài)或水平，對預測ALL患兒預后有一定意義。如果能找到理想的甲基化抑制劑，可能會使存在E-cadherin基因甲基化的患兒獲益。