二肽類代謝物生物學功能及分析方法研究進展

唐少冉，周煦婷，侯曉瑩，楊柳,3，許風國*，張培*

(1.中國藥科大學藥物質量與安全預警教育部重點實驗室，江蘇 南京 210009;2.江漢大學醫學院，武漢生物醫學研究院，湖北 武漢 430056;3.江蘇省腫瘤醫院，江蘇 南京 210009)

二肽由兩個氨基酸分子通過肽鍵連接形成，平均分子量約260 Da。二肽組成簡單但結構多樣，僅20個構成蛋白質的基本α-氨基酸就可組成400個二肽。除此之外，體內尚有多達數百種非必需氨基酸亦可作為二肽的組成單元。現有研究認為，人體內的二肽類代謝物主要來源于膳食攝入后的蛋白質消化吸收和內源性蛋白降解，廣泛存在于體液、細胞和組織等生物樣本中[1-2]。此外，體內還有一部分二肽由兩分子游離氨基酸通過酶促反應縮合而成[3-4]。二肽在體內發揮著重要的營養學功能和生物學功能，近年來有研究報道，二肽還可作為肺癌、結腸癌和肝癌等疾病診斷和分型的潛生物標志物[5-7]。二肽是機體內一類重要的內源性小分子代謝物，分布廣泛、種類繁多、功能多樣，近年來逐步引起人們的關注。但同分異構體多、濃度范圍廣、標準品缺乏也給二肽類代謝物的定性定量分析、生物學功能研究帶來巨大挑戰。

1 二肽的轉運吸收

1.1 吸收 人體內二肽類代謝物主要來源于消化道吸收。過去研究認為，蛋白質經消化道酶促水解后，全部以氨基酸的形式被腸道吸收[8]。隨后的研究揭示，人體吸收蛋白質的主要形式還包括寡肽，尤其是二肽和三肽，以寡肽形式的蛋白吸收率相比于氨基酸提高了2～2.5倍，這是人體胃腸道吸收蛋白質機制研究的重大突破[9-11]。吸收進入細胞的二肽一部分被胞漿中的肽酶水解后形成游離氨基酸，用于細胞本身代謝合成或被基底側的氨基酸轉運系統運至體循環；另一部分具有抗水解酶活性的二肽則可直接通過基底側的肽轉運體被完整地轉運至體循環，之后被血漿中的可溶性蛋白酶降解為氨基酸(見圖1)[12-14]。

1.2 轉運 寡肽轉運載體(POTs)家族中的PepT1(SLC15A1)、PepT2(SLC15A2)、PHT1(SLC15A4)和PHT2(SLC15A3)是目前已知的人體內二肽類代謝物的轉運體。關于PepT1和PepT2研究較多，而對PHT1和PHT2研究則較少，其具體功能尚不清楚。PepT1是低親和力、高容量的肽載體，主要在小腸上皮細胞中表達。二肽通過PepT1穿過腸上皮，最終進入血液循環、器官及細胞組織，迅速發揮生理作用[15]。PepT2是高親和力、低容量的肽載體，主要在腎髓質細胞和上皮細胞的刷狀緣膜側表達中表達，可以重吸收腎小球濾過的二肽[16-17]。二肽轉運系統主要是pH依賴性的H+-Na+交換轉運體系(見圖1)。在轉運過程中H+向細胞內電化學質子梯度供能，質子向細胞內轉運產生的動力驅使二肽以易化擴散的形式進入細胞，引起胞漿的pH值下降，進而活化Na+-H+通道，H+被釋放出細胞，細胞內的pH恢復到初始水平[18]。除二肽轉運體外，一部分二肽可通過細胞旁途徑穿過腸上皮膜，直接通過上皮細胞之間的緊密連接(tight junctions)進入細胞間隙而被吸收[19]。研究發現，二肽轉運體更傾向于運輸帶有中性電荷的極性疏水二肽，而親水性、中性或帶負電荷、小分子量二肽則更易經緊密連接的胞外通路運輸[12]。

圖1 二肽轉運吸收示意圖

2 二肽的生物學功能

2.1 營養調節作用 二肽與游離氨基酸的吸收分別依賴于各自的蛋白轉運體進行(見圖1)，既相互獨立又互為補充。吸收進入細胞的部分二肽可以水解成游離氨基酸，有助于減弱由于游離氨基酸之間相互競爭共同吸收位點而產生的拮抗作用，增加細胞內氨基酸吸收量，加速蛋白質合成，從而發揮營養調節作用。Paulussen等[20]研究了Leu-Leu攝入后對餐后肌肉蛋白質周轉代謝的影響，Leu-Leu通過刺激人體中肌纖維蛋白質的合成，從而提高血漿中Leu-Leu的濃度以及肌肉蛋白質的周轉率。Mantuano等[21]對Ala-Ala作為營養補充劑對骨骼肌萎縮的影響進行了研究，發現Ala-Ala可以增加支鏈氨基酸的生物利用度，改善肌肉萎縮。另有研究表明，添加Gln-Gln強化的腸外營養，可以改善重癥患者的預后，顯著降低重癥患者的感染率及住院時間[22]。

2.2 生理調節作用

2.2.1 促細胞增殖 已有研究揭示，蛋白質水解產生的某些二肽具有促細胞增殖的作用。成纖維細胞在傷口愈合中發揮重要作用，其能形成肉芽組織，合成胞外基質化合物。研究發現，小鼠皮膚傷口愈合處內源性膠原蛋白降解可產生Pro-Hyp，Pro-Hyp能促進附著在膠原蛋白上的成纖維細胞的生長[23]。Hyp-Gly也被證實具有促成纖維細胞增殖的功能[24]。另外，Pro-Hyp還可以提高海馬內腦源性神經營養因子和神經生長因子的基因表達，促進海馬神經細胞增殖，從而發揮抗抑郁活性[25]。除上述來自膠原蛋白水解的含有Hyp的二肽外，Tyr-Gly也被證實具有促進人外周血淋巴細胞增殖的作用[26]。

2.2.2 抗炎活性 炎癥是生物組織受到某種刺激如外傷、感染等損傷因子的刺激所發生的一種以防御反應為主的基本病理過程。一般情況下，炎癥是有益的，但過度炎癥反應則會造成機體損傷，并且炎癥與癌癥的發生發展密切相關。研究發現，多種二肽具有抗炎活性。Ano等[27]報道，口服Trp-Met可以抑制阿爾茨海默癥模型小鼠大腦炎癥反應，推斷可能是Trp-Met口服后被輸送到大腦，通過抑制腦內單胺氧化酶B的活性，從而抑制大腦中的炎癥反應。Engevik等[28]報道，TNBS(2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid solution)誘導的結腸炎小鼠灌胃給予γ-Glu-Cys后，組織中促炎細胞因子水平顯著降低，提示該二肽具有抗炎活性。El-Lekawy等[29]研究了Ala-Gly對胃潰瘍大鼠的作用效果，結果顯示Ala-Gly可以使NF-κB p65失活發揮其抗炎作用，從而促進胃潰瘍愈合。Cruzat等[30]研究發現，內毒素血癥小鼠口服Ala-Gln后，體內的谷氨酰胺的利用度顯著增強，證實Ala-Gln通過抑制NF-κB通路發揮抗炎作用。

2.2.3 神經類活性 二肽可以作為神經遞質通過間接刺激腸道受體激素或酶的分泌而發揮作用。肌肽是一種組氨酸二肽，被認為可能是嗅覺受體神經元中的一種的神經遞質[31-32]。研究發現，肌肽可以刺激下丘腦-垂體-腎上腺軸，從而發揮類似興奮劑樣作用[33]。Tyr-Trp可以增強去甲腎上腺素的合成和代謝，并可以改善由β-淀粉樣肽(25～35)所致小鼠學習記憶障礙[34]。此外，芳香二肽也具有神經類活性，如 Tyr-Arg、Tyr-Leu、Phe-Leu 和Trp-Leu表現出較強的抗焦慮活性[8,35-36]。Tyr-Arg還具有鎮痛作用[35]，Tyr-Leu具有抗抑郁作用[37]。

2.2.4 降血壓活性 研究表明，從沙丁魚肌肉水解液中提取的二肽Val-Tyr、Val-Trp、Ile-Tyr和Ile-Trp均有降血壓作用[38-40]。進一步的機制研究發現[41]，Val-Tyr主要通過抑制腎素-血管緊張素系統中的血管緊張素轉換酶發揮降血壓作用。

2.2.5 降血脂活性 Aldini等[42]發現肌肽具有顯著降血脂活性，能夠降低肥胖Zucker大鼠的肥胖相關疾病(高血脂、高血壓、糖尿病和肥胖性腎病等)的發生。也有研究表明，人體補充含組氨酸的二肽(如肌肽)可以降低脂肪量，減少中心性肥胖[43]，但是目前肌肽降脂機制尚不清楚。除肌肽外，Trp-Glu也被證實具有降脂作用，其可能機制是通過激活過氧化物酶體增殖物激活受體-α增加細胞脂肪酸攝取，從而減少肝細胞中的肝脂積累[44]。

2.2.6 其他作用 除促細胞增殖、抗炎、神經類活性、降血壓、降血脂外，二肽亦可發揮多種生物學功能。Matsui等[45]人研究發現，載脂蛋白E基因敲除后動脈粥樣硬化小鼠口服Trp-His可有效減輕動脈粥樣硬化病變。Khedr等[46]報道，Trp-Leu可以通過調節血管內皮生長因子進而抗血管生成。Nakato等[47]篩選了具有調節胃饑餓素釋放的二肽代謝物，發現Leu-Ile和Ser-Val分別表現出最強的胃饑餓素釋放抑制和刺激作用，并且Leu-Ile降低了小鼠的血漿胃饑餓素水平，Ser-Val增加了小鼠攝食量(見表1)。

表1 二肽生物學功能匯總表

3 二肽類代謝物的分析

目前用于二肽類代謝物分析的儀器方法有氫核磁共振(1H-NMR)、氣相色譜-質譜聯用(GC-MS)、液相色譜-質譜聯用(LC-MS)和毛細管電泳-質譜聯用(CE-MS)等均被報道。LC-MS將液相色譜的高效分離特性和質譜的強大定性和定量優勢有機結合，是目前二肽類物質分析中最有潛力且應用最多的分析手段[48]。但由于二肽類代謝物結構的特殊性，LC-MS在二肽類代謝物高靈敏、寬覆蓋檢測上仍面臨巨大挑戰。首先，二肽類代謝物濃度范圍廣(fmol·L-1～mmol·L-1)[1,13,49]，一般質譜的動態范圍難以滿足分析要求；其次，二肽類代謝物的組成單元中存在互為同分異構體的氨基酸(亮氨酸與異亮氨酸)，且氨基酸連接順序不同可產生順序異構體，使得二肽在常規色譜柱上的分離難以實現。目前，基于LC-MS的二肽代謝物分析方法包括非靶向代謝組學、靶向代謝組學、化學衍生化輔助的靶向測定等。

3.1 二肽類代謝物的定性分析 隨著高特異性、高靈敏度質譜的興起和各類離子源的快速發展，二肽的鑒定分析技術愈加成熟。但是二肽自身的質譜信息較為簡單，難以產生豐度較高的定性碎片離子進行無歧義結構鑒定，因此研究者多借助化學衍生化來豐富二肽的質譜結構信息。Madmon等[50]采用 LC-ESI-MS/MS技術獲取二肽的[M+H]+、[M+Na]+以及二肽氨基甲酸酯衍生化之后的質譜裂解信息，綜合多種碎片離子信息對二肽進行結構表征。Poliseli等[51]開發了一種5 min快速LC-ESI-MS/MS分析方法，其基于二肽中羧基的中性丟失46 Da，對乳清蛋白以及豬肝蛋白水解物中的二肽進行鑒定，分別鑒定出18和14種二肽。Tang等[52]利用二甲基標記和未標記二肽的MS/MS圖譜比對，對二肽中氨基酸序列進行識別，并建立二肽結構預測的MS/MS圖譜數據庫。Li等[53]借助激光輔助化學轉移技術結合衍生化試劑4-羥基-3-甲氧基肉桂醛對組織中二肽化學衍生化后，使用MALDI-MS對組織中二肽進行原位檢測分析，并應用該策略對大鼠腦組織中34種二肽的空間分布進行了表征。

3.2 二肽類代謝物的定量分析 二肽類代謝物定量分析方法按是否衍生化可分為兩大類：直接代謝組學分析和基于化學衍生化的靶向測定，而代謝組學分析中又包括非靶向和靶向兩種方法。

3.2.1 非靶向代謝組學 很多研究者利用非靶向代謝組學分析方法，在不同疾病模型中，發現了二肽類差異代謝物。Hou等[54]采用UPLC-IT-TOF/MS非靶向代謝組學方法，尋找腸道菌群介導的FOLFOX抗結腸癌療效個體差異的潛在生物標志物，發現小鼠糞便樣本中Phe-Val、Leu-Gln、Ile-Ala在FOLFOX敏感和非敏感個體間存在顯著差異。Li等[5]對3 482名志愿者血清樣本進行非靶向代謝組學分析，發現Glu-Leu可作為結腸癌早期診斷的生物標志物。Vallianatou等[55]應用UPLC-MS/MS對睡眠期間小鼠大腦的氨基酸及二肽進行非靶向代謝組學分析，揭示晝夜節律與不同大腦區域特有的二肽代謝之間存在顯著相關性。

3.2.2 靶向代謝組學 在質譜聯用法中可直接對生物樣本中的二肽進行定量或半定量分析。然而二肽類代謝物一般極性較大，在反向色譜柱上難以保留，如果對其直接進行LC/MS分離分析，一般會選用對極性化合物保留強的親水色譜柱或耐水型色譜柱。Ozawa等[1]建立LC-MS/MS和CE-MS/MS兩種分析方法應用大于鼠肝臟中335種二肽的定量分析，兩種分析方法的結合可對二肽中的同分異構體進行有效分離并準確定量。Nogimura等[25]用LC-MS/MS多重反應監測模式直接對血漿中Pro-Hyp和Hyp-Gly進行了含量測定。

3.2.3 化學衍生化輔助的定量測定 二肽類代謝物一般極性較大，在反向色譜柱上分離困難，不易離子化，而且二肽結構的質譜信息缺乏，難以產生穩定的定量特征碎片離子。在此情況下，科研人員也嘗試將化學衍生化技術與LC/MS聯用技術結合，將強極性的二肽轉化為適于反相色譜分離并易于質譜離子化的化合物。雖然引入化學衍生化使得分析流程復雜、耗時費力且容易引入誤差，但對于復雜體系中的特殊性質(如低豐度、難離子化、種類多、濃度范圍寬、無內標等)物質的檢測往往能實現1+1>2的效果，可以極大提高常規LC/MS整體性能。經化學衍生化之后的二肽色譜保留增強、離子化效率提高、定性定量碎片離子對信息豐富。目前，二肽的衍生化反應主要是針對二肽中的氨基，衍生化試劑有丹磺酰氯(DNSCl)[6]、6-氨基喹啉基-N-琥珀酰-亞胺基甲酸酯(AQC)[24,49]、三硝基苯磺酸(TNBS)[56]等。不同的衍生化試劑與二肽發生反應的方程式分別如圖2所示。

A.DNSCl;B.AQC;C.TNBS

4 結語與展望

二肽類物質結構簡單、組成多樣、活性繁多，其生物學機制及與疾病的關聯值得深入研究。目前對于內源性二肽代謝物研究還處于起步階段，對其種類、數量及產生過程認識有限，文獻報道或數據庫收錄的代謝物較少且只有極少部分標準品可得，未知代謝物結構難以有效鑒定，二肽類代謝物的高靈敏、寬覆蓋定量分析仍然面臨諸多挑戰。針對二肽類代謝物種類多且結構復雜、標品來源受限的問題，可采用擬靶向代謝組[57]學和一測多評[58]的分析方法，實現基于有限標品的寬覆蓋定量測定。針對該類代謝物離子化效率低、質譜響應差的問題，可利用化學衍生化實現高靈敏測定。未來針對該類物質設計反應效率高、衍生化產物穩定性好、質譜增敏效果好的衍生化試劑尤為重要。針對此類代謝物同分異構體的分離分析難題，可考慮采用多維度(保留時間、離子淌度、特征碎片)整合分析方法，改善分離、提高鑒定可信度。隨著基礎研究和分析方法的快速發展，未知二肽代謝物的發現，二肽的轉運吸收、與受體之間的相互作用新機制，二肽在不同疾病中的關鍵作用發現與驗證，將成為未來研究熱點。