基于中紅外技術的大薊及小薊鑒別研究

張詩華，郭朝暉，倪琳，宋平順，李辰荃

(1.甘肅中醫藥大學藥學院，甘肅 蘭州 730030；2.甘肅省藥品檢驗研究院，國家藥品監督管理局中藥材及飲片質量控制重點實驗室，甘肅省中藏藥檢驗檢測技術工程實驗室，甘肅省中藥品質與安全評價工程技術研究中心，甘肅 蘭州 730070)

大薊為菊科植物薊(CirsiumjaponicumFisch.ex DC.)的干燥地上部分。通常在夏、秋二季大薊花開時收割干燥地上部分，除去雜質并干燥。其性味甘、苦，涼。在臨床上常用于衄血，吐血，尿血，便血，崩漏，外傷出血，癰腫瘡毒。小薊為菊科植物刺兒菜[Cirsiumsetosum(Willd.)MB.]的干燥地上部分[1]。大薊和小薊在全國各地均有栽培，由于市場流通混亂，常將小薊作為大薊進行交易，導致臨床藥效參差不齊。二者雖均能涼血止血，解毒消癰，主治血熱型出血，熱毒瘡瘍，但是小薊涼血止血作用強，解毒之力不如大薊；大薊涼血止血作用不如小薊，而解毒療瘡作用較強[2]。所以大薊和小薊在臨床上不得混用。

當前中藥鑒別方法包括傳統鑒別方法和現代鑒別方法，傳統鑒別方法主要是利用觸覺、嗅覺、視覺、味覺等感官方法，或火試、水試等方法進行鑒別，對中藥飲片的種類、真偽等加以判斷；現代鑒別方法主要是采用顯微技術，利用組織鑒別法、粉末鑒別法、化學分析方法等進行顯微分析[3]。這些方法操作簡便，但準確率有待商榷。同時中藥及其中藥制劑所含化學活性成分復雜多樣，對所有化合物進行定性定量也十分困難，而且某些活性成分在治療方面也具有協同加和作用[4]，因此單一成分含量也不能準確的評價中藥質量。

中紅外光譜指紋圖譜目前已經應用于中藥活性成分，真偽鑒別、質量控制等方面的研究[5-12]。TQ、SIMCA兩款軟件可對光譜進行分析，目前TQ軟件已經在前胡的快速鑒別[13]、三七的真偽鑒別[14]、天麻有效成分的快速定量[15]等方面中有所應用。SIMCA判別分析也已經在不同產地山藥的鑒別[16]、金銀花與山銀花的區分判別[17]、硫熏白芍的快速鑒別[18]等方面廣泛應用。

本實驗通過收集不同產地的大薊及小薊樣品，采集大薊與小薊的中紅外光譜，利用TQ軟件和SIMCA軟件建立主成分分析-馬氏距離與正交偏最小二乘判別模型，為鑒別大薊與小薊及質量評價提供一定參考。

1 儀器與材料

1.1 樣品收集 2021年共收集44份不同產地的大薊及小薊樣品，樣品信息見表1。本研究中的大薊、小薊樣品均由甘肅省藥品檢驗研究院宋平順主任藥師收集并鑒定。經過觀察發現大薊及小薊樣品的表面顏色、葉片形狀等性狀差異性較小，如果僅憑肉眼觀察和顯微觀察無法準確地區分。

表1 大薊和小薊樣品信息

為了方便區分，將所有樣品編號后，統一進行干燥。具體干燥方法是將大薊、小薊樣品在45 ℃烘箱中干燥12 h，每4 h翻動一次。干燥處理后將樣品放置于真空干燥器中冷卻至室溫。將干燥后的樣品粉碎并過80目篩，以得到大小均一的大薊和小薊粉末，粉末樣品保存于自封袋中，放陰涼干燥處貯存備用。

1.2 儀器 PC-12型號壓片機(天津精拓儀器科技有限公司);Spectrum Two傅立葉變換紅外光譜儀(PerkinElmer北京儀器有限公司)；A11basic025沖擊式粉碎機(德國IKA)；QUINTTX224-1CN萬分之一天平(德國賽多利斯)；JB2018940標準檢驗篩(紹興市張興紗篩廠)；9240A型號電熱鼓風干燥箱(北京蘭貝石恒溫技術有限公司)。

1.3 樣品處理 取粉碎后的樣品置于研缽，加入溴化鉀(光譜級)研磨后放置于高溫燈下備用。每掃描一個樣品均采集一次背景，一批樣品在相同條件下進行5次掃描。參數設定：光譜掃描范圍在4 000～400 cm-1，掃描次數14次，溫度20 ℃，空氣相對濕度70%；掃描時扣除H2O和CO2的干擾，每種樣品平行測量5次，取平均光譜[19]。大薊及小薊樣品原始中紅外光譜圖見圖1～4。

圖1 大薊樣品原始中紅外光譜

1.4 方法學驗證 選取隨機樣品進行方法學考察，選取中紅外光譜中吸收強度最大的5個特征峰作為評價峰，考察儀器的精密度、樣品的穩定性、操作可重復性，以對應波長的相對標準偏差最為評判依據。

1.4.1 精密度試驗 樣品連續測定5次，得到紅外光譜并計算RSD值，結果顯示RSD值均小于1.45%，表明儀器的精密度良好。

1.4.2 穩定性試驗 取同一樣品壓片，壓片后放入真空干燥器中進行保存。每隔30 min進行一次光譜采集，測定5次，得到紅外光譜并計算RSD值，結果顯示RSD值均小于1.89%，表明該樣品的穩定性良好。

1.4.3 重復性試驗 將樣品平行制樣5份，分別進行測定，得到紅外光譜并計算RSD值，結果顯示圖譜RSD值均小于0.99%，表明方法的可重復性良好。

2 光譜分析結果

由圖可知，大薊和小薊樣品中紅外原始光譜存在以下特征：整體可見，不同產地的大薊和小薊中紅外光譜走勢和主要吸收峰的位置基本相同，說明不同產地的大薊以及不同產地的小薊質量總體穩定。4 000～1 300 cm-1稱為官能團區，1 300～600 cm-1的區域，除單鍵的振動外，還有因變性振動產生的復雜光譜，這一區域稱為指紋區。

由圖2大薊圖譜可以看出，其中3 010.4 cm-1處的峰為C-H伸縮振動吸收峰；2 864.7 cm-1處的峰是甲基的對稱伸縮吸收峰；1 718.2 cm-1為羰基C=O伸縮振動吸收峰；1 490.3 cm-1和1 525.1 cm-1附近為芳香環骨架振動吸收峰；1 389 cm-1與1 347.8 cm-1為C-H彎曲振動吸收峰；1 300～910之間主要為各類C-O的伸縮振動。

圖2 大薊樣品紅外光譜及吸收峰圖

由圖4小薊圖譜可以看出3 000.4 cm-1處的峰為C-H伸縮振動吸收峰，2 861.4 cm-1處的峰是甲基的對稱伸縮吸收峰，1 715 cm-1為羰基C=O伸縮振動吸收峰，1 487.5 cm-1和1 557 cm-1附近為芳香環骨架振動吸收峰，1 389.6 cm-1與1 348.6 cm-1為C-H彎曲振動吸收峰，1 300～910 cm-1之間主要為各類C-O的伸縮振動，通過對比可以看出，小薊在1 557cm-1、754.78 cm-1和489.33 cm-1附近有吸收峰，而大薊在這幾處的峰不顯著，大薊在907.6 cm-1附近有吸收峰，而小薊在此處吸收不明顯。

3 建立模型

3.1 主成分分析-馬氏距離(PCA-MD)判別模型 使用TQ Analyst軟件對光譜進行優化處理，光譜中除了樣本本身信息之外，還包括了一些無用信息，噪聲等，因此本文采用多元散射校正法(MSC)、標準正態變量變換(SNV)、一階導數(FD)、二階導數(SD)、SG平滑、ND平滑的組合方法去除光譜中存在的無用信息[20]，以提高判別模型的準確性。通過表2可知，通過分析選擇的預處理方法為MSC+ND+SD。

在對原始光譜預處理的基礎上采用主成分分析-馬氏距離判別分析方法，選取的光譜范圍為3 930.22～520.69 cm-1，從中選取8個為驗證集，212個為預測集。判別模型結果見表2和圖5。在表2中可見模型的性能指數(performance index)為95.7，其預測率(previous)為95.0，表明建立的PCA-MD判別模型是合理有效的，MSC+ND+SD可以作為大薊和小薊光譜的有效處理方法。如圖5所示，可以看出大薊樣品和小薊樣品有良好的區分度。

表2 光譜預處理方法

圖3 小薊樣品原始中紅外光譜

圖4 小薊樣品紅外光譜及吸收峰圖

圖5 PCA-MD判別模型圖

3.2 正交偏最小二乘法判別分析(OPLS-DA)判別模型的建立 采用SIMCA 14.0軟件，建立大薊與小薊樣品的正交偏最小二乘法判別模型，OPLS-DA模型中的R2Y代表積累的自變量X對Y的解釋能力，Q2代表模型的預測能力。在所設計的模型中R2Y的值為0.95，Q2的值為0.944，OPLS-DA模型判別結果見圖6，由圖6可知，大薊與小薊的中紅外光譜信息是具有差異性的。在OPLS-DA模型建立的基礎上，采用SIMCA軟件對其進行置換檢驗，排列數為200，結果見圖7。由圖7可知，R2的截距值為0.037 2，Q2的截距值為-0.179<0.05，表明所建立的模型是穩定有效的，且沒有過度擬合，可用于判別大薊及小薊樣品。

圖6 OPLS-DA模型判別結果

圖7 置換檢驗結果

4 討論

目前對大薊小薊的區分鑒別集中在顯微和含量成分測定方面。易炳學等[21]測定大薊小薊中含量發現柳穿魚葉苷可以作為大薊和小薊藥材區別的依據。倪曉霓等[22]建立了反向高效液相色譜分析方法，利用大薊、小薊黃酮類化合物的指紋圖譜來鑒別二者。胡建平等[23]利用聚酰胺薄層色譜法進行層析，以此來鑒別大薊。梁鸝等[24]對大薊與小薊的顯微進行鑒別研究，發現大薊、小薊的橫切面顯微特征可從莖及葉維管束排列緊密程度來進行區分;粉末的顯微特征可從多細胞非腺毛的細胞個數來進行區分。張景景等[25]研究表明ITS2序列可以鑒定大薊藥材。但以上方法操作均較為復雜。

本研究中所用到的PCA-MD與OPLS-DA 模型均是模式識別的方法，其中PCA-MD為無監督的方法，主成分的提取是采用降維的方法，提取出有用的光譜信息，本實驗中所建立的PCA-MD 判別模型對大薊和小薊的鑒別率僅達到 95.0%，因此建模波段與建模方法需進一步優化以便實現準確區分。而 OPLS-DA為有監督的方法，由于OPLS-DA方法同時對光譜陣和類別陣進行分解，加強了類別信息在光譜分解時的作用，以提取出與樣本類別最相關的光譜信息，即最大化提取不同類別光譜之間的差異[26]，因此 OPLS-DA方法通常可以得到比基于 PCA 的識別方法更優的分類和判別結果，基于此進一步對光譜波段進行了優化，建立了OPLS-DA判別模型并對其進行驗證，發現該模型鑒別率能夠達到94.4%。

本研究首次通過中紅外光譜實現了對大薊和小薊樣品的準確鑒別，該方法操作簡單，建立的判別模型準確可靠，可為相似中藥材的鑒別提供新的思路。