谷氨酰胺代謝對巨噬細胞表型極化的調控作用研究

王卓,李嫻靜，張啟春

(1.南京中醫藥大學藥學院，江蘇 南京 210023；2.中國藥科大學藥物科學研究院，江蘇 南京 211198)

巨噬細胞是機體中一類非常重要的免疫細胞，廣泛分布于機體的各個組織中，參與調節機體的組織穩態[1]。巨噬細胞具有極強的可塑性和異質性，在LPS或干擾素的刺激下，表現出經典型極化即M1極化，表達大量的促炎因子如白介素-6(interleukin 6,IL-6)、白介素-1β(interleukin 1β，IL-1β)、白介素-12(interleukin 12，IL-12)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor-α，TNF-α)以及誘導性一氧化氮合成酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)等，同時高表達抗原提呈相關分子如MHCII、CD86、CD80等，殺傷病原體和腫瘤細胞,發揮抗腫瘤抗感染的作用；相反，巨噬細胞在IL-4或IL-13的刺激下，表現出替代性極化即M2極化，高表達抑炎因子TGF-β、IL-10、精氨酸酶(arginase 1,Arg1)等，抑制炎癥反應，促進血管生成，參與組織重塑與修復。健康狀態下，機體中的巨噬細胞處于M1與M2動態平衡中，若M1極化高強度持續存在，過度炎癥導致自身組織損傷，若M2極化持續存在，則不利于機體有效清除病原體。因此，巨噬細胞極化的精確調控對于機體組織穩態至關重要。

谷氨酰胺(glutamine,Gln)是體內含量最豐富的氨基酸，在機體創傷及感染時，被視為“條件必需氨基酸”[3]。谷氨酰胺是許多細胞和組織最重要的能源物質，尤其是免疫細胞如淋巴細胞、中性粒細胞、巨噬細胞等，它們對Gln的利用率遠遠超過其他氨基酸[4]。但Gln對巨噬細胞表型的調控作用尚不明確，本實驗研究Gln對原代巨噬細胞表型的調控作用，為Gln的臨床應用奠定實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SPF級C57BL/6小鼠10只，體重20～22 g，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，動物生產許可證號：SCXK(滬)2017-0005。實驗動物使用許可證號：SYXK(蘇)2018-2019。在中國藥科大學新藥安全評價研究中心飼養，自由進食飲水，適應性飼養3 d后進行實驗。

1.1.2 主要試劑 DMEM(不含谷氨酰胺)購自Thermo Fisher公司；Trizol、實時定量PCR反轉錄試劑盒、SYBR Green Real-time Master購自TaKaRa；CB839購自MCE；重組小鼠M-CSF購自Peprotech。

1.1.3 引物序列 具體見表1。

表1 Real-time PCR引物序列表

1.2 方法

1.2.1 骨髓來源巨噬細胞(bone marrow derived macrophage,BMDM)提取 將小鼠脫頸處死，浸泡于裝有75%酒精的燒杯，浸泡2 min左右；取下小鼠脛骨和股骨；用注射器(2.5 mL)吸取PBS沖出骨髓中細胞；離心，300 g，5 min,4 ℃；2 mL培養基將細胞重懸，用70 μm濾器過濾細胞，去除結締組織及骨頭等非細胞成分；將過濾所得的細胞再次離心，棄上清，加10 mL含100 ng·mL-1M-CSF的培養基重懸后加至10 cm培養皿，該細胞繼續培養使其分化，每3 d換液一次，第6天后進行藥物處理。

1.2.2 巨噬細胞藥物處理 ①谷氨酰胺剝奪處理：BMDM培養至第6天，鋪6孔板，每孔1×106個細胞；將細胞分為兩組：+ Gln組(正常培養基)及-Gln組(無谷氨酰胺培養基)，各6個孔，處理6 h后將6孔板取出提取RNA。②谷氨酰胺抑制劑處理：將細胞分為3組：對照組、IL-4(50 ng·mL-1)、IL-4+CB-839(1 μmol·L-1)，每組各6個孔，孵育6 h后將6孔板取出提取RNA。

1.2.3 給藥后的巨噬細胞M1/M2標志物mRNA表達水平檢測 Trizol法提取RNA，超微量分光光度計檢測RNA的純度和濃度，使用Takara逆轉錄試劑盒將RNA逆轉為cDNA，去除基因組DNA，采用PrimerBank數據庫提供的引物序列，由金斯瑞生物科技有限公司合成引物。配置PCR反應液，采用兩步法PCR擴增程序，用每個樣本的目的基因Ct值減去內參基因Ct值：ΔCt樣本=Ct樣本-Ct內參；將對照組的ΔCt值取平均值ΔCt對照：ΔΔCt=ΔCt樣本-ΔCt對照，計算出2-ΔΔCt。

2 實驗結果

2.1 谷氨酰胺剝奪對骨髓來源的巨噬細胞表型極化的影響 如圖1所示，使用RT-PCR技術分別檢測剝奪谷氨酰胺與未剝奪谷氨酰胺的BMDMs中M1型特異性標志基因IL-12、IL-6、IL-1β、iNOS的表達水平。結果顯示，與未剝奪谷氨酰胺的BMDMs相比，剝奪谷氨酰胺的BMDMs的IL-12、IL-6、IL-1β、iNOS表達水平顯著增加。剝奪谷氨酰胺后，巨噬細胞中IL-12、IL-6、IL-1β、iNOS的基因表達水平分別增加了7.5、80、24、48倍，差異具有統計學意義(P<0.05)。

A.IL-12基因表達；B.IL-6基因表達；C.IL-1β基因表達；D.iNOS基因表達

2.2 谷氨酰胺酶抑制劑CB-839對M2型巨噬細胞表型極化的影響 如圖2所示，與對照組相比，IL-4組均顯著上調M2型特異性基因mRNA表達水平，如Arg1、Chil3、Mrc1表達水平相比對照組均顯著增加，差異具有統計學意義，表明IL-4成功誘導巨噬細胞M2型極化。同時給予 CB-839后，IL-4誘導M2型標志物的表達均顯著降低；此外，CB-839處理亦能促進M1型特異性基因IL-1β和iNOS的表達水平增加。以上結果表明CB-839能夠抑制BMDMs在IL-4誘導下向M2型極化的能力，增強其向M1型轉化的能力。

A.Arg1；B.Chil3；C.Mrc1；D.IL-1β；E.iNOS的mRNA表達水平(n=6；IL-4：50 ng·mL-1，CB-839：1 μmol·L-1)

3 討論

本研究通過實時定量PCR方法研究谷氨酰胺代謝對巨噬細胞極化的作用，發現谷氨酰胺剝奪抑制M2型極化，而谷氨酰胺酶抑制劑CB-839處理亦能抑制巨噬細胞M2極化且增加M1型標志基因的表達，表明谷氨酰胺代謝過程對巨噬細胞具有調控作用。

谷氨酰胺通過氨基酸轉運蛋白 ASCT2和 SN2穿過細胞膜，進入胞漿后，首先通過谷氨酰胺酶(GLS/GLS2)轉化為谷氨酸，谷氨酸通過谷氨酸脫氫酶(GLUD)或轉氨酶(如谷氨酸-草酰乙酸轉氨酶(GOT)、谷氨酸-丙酮酸轉氨酶(GPT)和磷酸絲氨酸轉氨酶(PSAT)兩條不同的途徑轉化為α-酮戊二酸(α-KG)[5]。谷氨酰胺酶抑制劑CB-839處理顯著抑制巨噬細胞M2極化且增加M1型標志基因的表達，表明谷氨酰胺代謝過程中產生的代謝物α-KG可能是巨噬細胞表型極化的關鍵分子。αKG是雙加氧酶催化底物羥基化的重要輔因子，其與Fe2+構成的雙加氧酶酶活中心結合，在氧氣的參與下，活化的兩個氧原子分別進攻底物和αKG，進而生成羥基化的底物[5]。組蛋白去甲基化酶KDM家族、DNA去甲基化酶Tets家族及RNA去甲基化酶ALKBH5、FTO等均為雙加氧酶。因此，αKG能夠介導全基因組水平的組蛋白、DNA及RNA甲基化狀態的改變，從而誘導細胞表觀重編程[6-7]。Liu等[8]研究發現αKG能夠抑制小鼠肺巨噬細胞M1極化，促進巨噬細胞M2極化，亦有研究顯示谷氨酰胺代謝產生的αKG促進腫瘤微環境免疫抑制性髓細胞的形成[9]。因此，谷氨酰胺代謝可能通過αKG介導巨噬細胞表觀重編程，從而促進巨噬細胞M2極化。CB-839已進入臨床試驗(NCT02071862)，已被證明在治療三陰性乳腺癌方面具有療效[10]，其有可能通過調控腫瘤微環境中的巨噬細胞M1極化從而增加其抗腫瘤功能。本研究為谷氨酰胺及其代謝過程抑制劑在臨床的合理應用提供理論依據。