香樟中芝麻素類成分測定方法構建及含量分析

郭茂，黃冰冰，李林海，林思榮，黃鳴清，倪林

(1.福建省食品藥品質量檢驗研究院，福建 福州 350012；2.福建農林大學植物保護學院，福建 福州 350002；3.福建中醫藥大學，藥學院，福建 福州 350122)

香樟(Cinnamomumcamphoravar.linalooliferaFujita)為樟科(Lauraceae)樟屬(Cinnamomum)常綠喬木植物[1]，是我國亞熱帶常綠闊葉林的主要樹種之一[2]，福建、臺灣、江西、廣東等地區均有分布[3]。福建林地水肥等條件適宜香樟生長，良種已全覆蓋，成為香樟精油的主產區。香樟枝葉用于精油提取后，大量枝葉殘渣被廢棄，植物資源利用率低[2]、嚴重污染環境，已成為產業發展亟需解決的關鍵科學問題。課題組致力于香樟資源的開發與利用研究，前期從枝葉提取物中分離、純化和鑒定化合物20余個[4]，其中兩個雙四氫呋喃木脂素類化合物，即芝麻素和9-羥基芝麻素含量大，具有良好的抗菌[5]、抗癌[6]、抗氧化[7]、抗炎[8]、降血壓[9]、降低膽固醇[10]、保肝[11]等功效，可用于農藥增效劑、食品、保健產品添加劑等[12]，市場前景廣闊。因此，本文構建了高效液相色譜(HPLC)法同時測定芝麻素和9-羥基芝麻素含量的方法，并對不同產地香樟原料進行測定，為香樟植物資源化學利用、開發芝麻素和9-羥基芝麻素制備工藝、產品質量標準等奠定基礎。

1 實驗

1.1 藥材、試劑與儀器 香樟樣品于2021年5月在福建泉州市安溪半林國有林場(北緯24°56′55″，東經117°59′36″，海拔728 m)和福建泉州市南安向陽鄉海山果林場(北緯25°17′38″，東經118°31′10″，海拔700 m)采集，經福建農林大學植物保護學院倪林博士鑒定為樟科樟屬樟(C.camphora)，從其樟油化學成分看，應為香樟(C.camphoravar.linalooliferaFujita)，品系有“南安1號”和“牡丹1號”。植物枝葉標本存放于福建農林大學自然生物資源保育利用福建省高校工程研究中心樣品室。

Diamonsil C18分析型反相色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)(北京迪馬科技有限公司)；分析純乙酸乙酯、甲醇等(北京化工廠)；色譜級甲醇、乙腈(德國Merck公司)；水為超純水。芝麻素和9-羥基芝麻素的對照品為實驗室自制，經ESI-MS、1H-NMR和13C-NMR測定，數據與文獻[4]對照一致，HPLC測定化合物純度，歸一化法計算質量分數為99%以上。

Waters W2695-QDA高效液相色譜儀(美國Waters公司)；PR224ZH/E型電子分析天平(美國OHAUS公司)；Millipore超純水系統(美國Millipore公司)；KQ50ODE型數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；TQ-400Y 高速多功能粉碎機(永康市天祺盛世工貿有限公司)。

1.2 溶液的配制

1.2.1 混合對照品溶液制備 分別取適量的芝麻素和9-羥基芝麻素對照品，精密稱定，加入適量乙酸乙酯稀釋定容至5 mL，制得對照品儲存溶液。分別量取1.0 mL對照品儲存溶液混合，即得芝麻素濃度為1.08 mg·mL-1、9-羥基芝麻素濃度為1.23 mg·mL-1的混合對照品溶液；再分別準確量取0.4 mL對照品儲存溶液混合，即得芝麻素濃度為0.08 mg·mL-1、9-羥基芝麻素濃度為0.08 mg·mL-1的混合對照品溶液。

1.2.2 供試品溶液制備 取適量陰干香樟樣品，粉碎，稱取2.0 g，置250 mL圓底燒瓶中，加入50 mL乙酸乙酯，稱總重，在加熱套中回流提取1 h，冷卻后補足差重，濾過，精密吸取4 mL置蒸發皿中，將溶劑吹干，殘渣加甲醇適量使溶解，并轉移至5 mL量瓶中，定容，即得。

1.3 HPLC測定含量方法的構建

1.3.1 色譜條件 采用Dikma Diamonsil C18分析型反相色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)，以乙腈(A)-水(B)為流動相，梯度洗脫(0～30 min,30% A → 42% A;30～45 min,42% A → 65% A)，流速1.0 mL·min-1,檢測波長為235 nm，柱溫30 ℃，進樣量10 μL。

1.3.2 系統適用性實驗 按照“1.3.1”項下色譜條件，分別取“1.2.1”項下配備的混合對照品溶液與“1.2.2”項下配備的供試品溶液進樣10 μL，記錄色譜圖。

1.3.3 線性關系考察 在“1.3.1”項下的色譜條件下，取“1.2.1”項下芝麻素濃度為0.08 mg·mL-1、9-羥基芝麻素濃度為0.08 mg·mL-1的混合對照品溶液分別進樣1、6、10、20 μL，取“1.2.2”項下芝麻素濃度為1.08 mg·mL-1、9-羥基芝麻素濃度為1.23 mg·mL-1的混合對照品溶液分別進樣2、4、6、8、10 μL，測定峰面積；以峰面積為縱坐標，分別以對照品的2個含量為橫坐標，繪制標準曲線。

1.3.4 精密度試驗 在“1.3.1”項下的色譜條件下，將“1.2.2”項下制備的混合供試品溶液連續吸取進樣6次，每次進樣10 μL，測定，分別記錄下芝麻素和9-羥基芝麻素的峰面積積分值，由此計算出兩個化合物的RSD。

1.3.5 穩定性試驗 在“1.3.1”項下的色譜條件下，將“1.2.2”項下制備的混合供試品溶液室溫放置0、2、4、8、12、24 h，分別進樣10 μL，測定，分別記錄下芝麻素和9-羥基芝麻素的峰面積積分值，由此計算出兩個化合物的RSD。

1.3.6 重復性試驗 取同一批香樟樣品6份，按“1.2.2”項下的方法分別制備6份供試品溶液，在“1.3.1”項下的色譜條件下分別測定，記錄芝麻素和9-羥基芝麻素的峰面積，計算相應的RSD。

1.3.7 加樣回收率試驗 精密稱取6份已知含量的香樟粉末，分別加入適量的混合對照品溶液，于“1.3.1”項下的色譜條件下測定，記錄芝麻素和9-羥基芝麻素的峰面積，計算加樣回收率。

1.3.8 含量測定 取香樟樣品，按“1.2.2”項下方法操作，并在“1.3.1”項下色譜條件下通過HPLC測定，以外標法計算樣品中芝麻素和9-羥基芝麻素的含量。

1.3.9 數據分析 利用Excel 2016和SPSS 26.0軟件對數據進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 樣品與對照品的HPLC分析 混合對照品和供試品的HPLC色譜見圖1。在235 nm檢測波長下，混合對照品和供試品兩者的芝麻素和9-羥基芝麻素分離度均大于1.5，實現完全分離，保留時間分別為30.488和43.624 min，即“1.3.1” 項下色譜條件方法可用于香樟中芝麻素和9-羥基芝麻素的含量測定。

A.對照品；B.樣品 1.芝麻素;2.9-羥基芝麻素

2.2 考察結果 對照品的線性回歸方程、線性范圍結果見表1。

表1 對照品的線性回歸方程、線性范圍

數據結果表明，芝麻素和9-羥基芝麻素在0.1～10 μg范圍內均有良好的線性關系；精密度試驗的RSD分別為0.29%和0.28%，表明該方法精密度良好，符合精密度考察要求；穩定性試驗的RSD分別為0.88%和0.67%，表明供試品溶液在24 h內穩定性良好；重復性試驗的RSD分別為0.55%和0.48%，表明該方法重復性良好。

2.3 加樣回收率試驗 加樣回收率試驗結果如表2所示。

表2 加樣回收率試驗結果

由加樣回收率試驗結果可以看出，兩個芝麻素類成分的平均加樣回收率分別為97.5%(RSD=0.77%)和98.4%(RSD=0.82%)，RSD均小于3%，表明該方法準確、可靠，可用于不同香樟植物原料中芝麻素類成分的測定。

2.4 含量測定 香樟樣品含量測定結果見表3～6。

表3 不同坡位的樣品中芝麻素和9-羥基芝麻素測定結果(mg·g-1,n=3)

香樟不同組織部位(枝條、葉片)中芝麻素類含量存在差異。3個不同采集地點的樣品中芝麻素和9-羥基芝麻素含量均表現為香樟葉片中最高，且香樟葉片中的芝麻素類含量遠高于枝條中含量，其中不同香樟組織部位的芝麻素類含量表現為：嫩葉>老葉>嫩枝>老枝，香樟嫩葉中的芝麻素和9-羥基芝麻素含量分別是老葉中含量的2倍和1.5倍。采集自不同坡位(上坡段、中坡段和下坡段)的3個香樟樣品中芝麻素類含量存在差異。坡位對其含量具有顯著影響，3個坡位的芝麻素類均含量表現為：上坡段>中坡段>下坡段。另外，對比“南安1號”和“牡丹1號”兩個品系，枝條和葉片中芝麻素類的含量均為“南安1號”品系最高。據已有文獻報道，香樟葉中芝麻素含量是芝麻的1～3倍[13-14]，是細辛的2～4倍[15]，是紫珠葉的10～22倍[16]，是兩面針的23～48倍[17]，且香樟葉中含量最高的化合物9-羥基芝麻素，其含量遠高于馬鞭草、黃毛豆腐柴、石榴等植物[18-19]。

表4 不同品系樣品中芝麻素和9-羥基芝麻素測定結果(mg·g-1,n=3)

表5 不同香樟組織部位中芝麻素和9-羥基芝麻素測定結果(mg·g-1,n=3)

表6 品系、坡位和香樟組織部位對芝麻素含量和9-羥基芝麻素含量的主體間效應檢驗

通過多元方差分析，3個主效應(品系、坡位與香樟組織部位)的4種檢驗統計量均小于顯著性水平0.05，說明三因素分別對兩個成分含量有顯著影響;“品系＊坡位＊香樟組織部位”的4種檢驗統計量均小于顯著性水平0.05，說明三因素交互共同對兩個成分含量的影響存在協同作用。通過兩個因變量(芝麻素和9-羥基芝麻素含量)在三因素上的差異分析，兩個成分含量在三因素的顯著性均為0.000(<0.05)，說明兩個成分含量在3個因素上都存在顯著差異。兩個成分含量在“品系＊坡位＊香樟樹組織部位”上的顯著性分別為0.000(<0.05)和0.002(<0.05)，所以，三因素的交互作用在兩個成分含量上均存在顯著差異。

香樟中芝麻素類成分的合成和積累會受到不同品系、不同種植坡位和不同組織部位的影響。種植于不同坡位的香樟，其生長環境有所不同，不同坡位的光照、土壤條件、水分和肥力等均有差異，且香樟嫩葉和嫩枝部位的光照條件優于老葉和老枝，葉片受光面積大于枝條，明顯種植在上坡位的香樟中芝麻素類成分含量最高。因此，光照、土壤、水分和肥力等環境條件對香樟中的芝麻素類成分的合成和積累會造成很大的影響。故在上坡位的環境下種植“南安1號”品系的香樟，在此條件下更有利于芝麻素類成分的合成和積累。香樟資源豐富，開發利用潛力較大，今后可著重利用“南安1號”品系香樟的葉片生產芝麻素系列產品，可替代芝麻成為新資源，彌補香樟植物資源利用不足問題，開發高附加值化學產品，有效延伸香樟產業鏈。

3 結論

3.1 建立了HPLC測定香樟中兩個芝麻素類成分含量的方法，該方法操作簡單，結果準確，各項方法學考察結果符合有關規定，為香樟的資源開發利用和質量評價提供科學依據。

3.2 種植上坡位的“南安1號”品系香樟的嫩葉中芝麻素類成分含量最高，芝麻素可達(2.596±0.27)mg·g-1，9-羥基芝麻素可達(4.171±0.21)mg·g-1。

3.3 不同品系、坡位及香樟組織部位對香樟中芝麻素類成分的含量具有協同作用，且對香樟中芝麻素類成分的合成和積累具有顯著影響。

3.4 香樟中芝麻素類成分的合成和積累會受到光照、土壤、水分和肥力等不同環境因素的影響。