基于譜效關系的核桃楸皮治療肝癌藥效物質基礎研究

王詩蒙，王帥，2，3，李天驕，2，3，孟憲生，2，3，包永睿，2，3*，趙琳*

(1.遼寧中醫藥大學藥學院，遼寧 大連 116600；2.遼寧省中藥多維分析專業技術創新中心，遼寧 大連 116600；3.遼寧省現代中藥研究工程實驗室，遼寧 大連 116600)

核桃楸皮為胡桃科植物核桃楸(JulansmandshurecaMaxim.)的枝皮或干皮，主要分布于東北、河北、山西等地。其苦，辛，性微寒。《開寶本草》中最早記載核桃楸有補腎固精、斂肺定喘、抑菌鎮咳及抗癌之功效[1]，主治濕熱下痢、目赤腫痛、瞼腺炎、迎風流目、骨結核等[2]?，F代研究表明，核桃楸皮中含有醌類、黃酮類、揮發油類、苷類、鞣質、多酚、多糖等化學成分[3]，具有抗菌、抗氧化、抗腫瘤等作用。目前對核桃楸皮的研究主要集中在藥理作用[4-6]等方面，關于藥效物質研究的文獻報道相對較少。

本研究采用高效液相色譜(HPLC)法建立了核桃楸皮不同極性部位的指紋圖譜；采用CCK-8法進行核桃楸皮治療肝癌的體外藥效研究；運用灰色關聯度分析法和偏最小二乘回歸分析法兩種分析方法，將指紋圖譜與體外抗肝腫瘤藥效相關聯，建立了核桃楸皮治療肝癌的譜效關系，明確了核桃楸皮活性部位與抗肝癌藥效之間的關聯性，篩選出了核桃楸皮治療肝癌的藥效物質，初步揭示了其治療肝癌的藥效物質基礎，為核桃楸皮的藥物代謝及作用機制研究提供前期基礎。

1 實驗材料

1.1 儀器 1260 Ⅰ型快速高效液相色譜儀(美國安捷倫科技有限公司)；SUNRISE酶標儀(瑞士TECAN公司)；US AUTOFLOW型CO2培養箱(德國NU-AIRE公司)。

1.2 試劑與藥物 核桃楸皮藥材由丹東藥業集團提供，經遼寧中醫藥大學許亮教授鑒定為胡桃科胡桃屬植物核桃楸(JulansmandshurecaMaxim.)的枝皮或干皮；阿魏酸、槲皮苷、柚皮素、山柰酚(成都普菲德生物技術有限公司，批號分別為17120702、151016、17061301、130708)；丁香酸、沒食子酸、鞣花酸(四川維克奇生物科技有限公司，批號分別為21090106、170824、22012407)；胎牛血清(美國GIBCO公司)；DMEM高糖培養基(美國 GIBCO公司)；胰蛋白酶(美國GIBCO公司)；青霉素/鏈霉素溶液(Meilunbio公司)；CCK-8增強型溶液細胞活性檢測試劑盒(Meilunbio公司)。

1.3 細胞株 人肝癌細胞株HepG2，購自武漢普諾賽生命科技有限公司。

2 方法與結果

2.1 核桃楸皮指紋圖譜研究

2.1.1 供試品溶液的制備 取核桃楸皮粉末(過3號篩)適量，分別加入10倍量的乙酸乙酯、70%乙醇溶液、正丁醇、氯仿、石油醚、水，加熱回流提取2 h，放冷，抽濾，揮干，制得核桃楸皮不同極性部位提取物。

精密稱取核桃楸皮不同極性部位提取物0.2 g，置于10 mL容量瓶中，甲醇溶解并稀釋至刻度，0.22 μm微孔濾膜過濾，制成濃度為0.02 g·mL-1的供試品溶液。

2.1.2 對照品溶液的制備 精密稱取沒食子酸、丁香酸、阿魏酸、鞣花酸、槲皮苷、柚皮素、山柰酚對照品適量，置于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，分別制得濃度為0.159、0.118、0.154、0.192、0.155、0.115、0.884 mg·mL-1的對照品溶液。

精密稱取各對照品適量，加甲醇制成含沒食子酸0.034 mg·mL-1、丁香酸0.026 mg·mL-1、阿魏酸0.009 mg·mL-1、鞣花酸0.038 mg·mL-1、槲皮苷0.030 mg·mL-1、柚皮素0.022 mg·mL-1、山柰酚0.017 mg·mL-1的混合對照品溶液。

2.1.3 色譜條件 色譜柱：Agilent Poroshell SB-C18色譜柱(4.6 mm×100 mm，2.7 μm)；流動相：0.1%甲酸水(A)-甲醇(B)；梯度洗脫程序：(0～2 min，10%→15%B；2～4 min，15%→19%B；4～9 min，19%→36%B；9～12 min，36%→37%B；12～14 min，37%→38%B；14～30 min，38%→70%B；30～43 min，70%→87%B；43～55 min，87%→100%B)；流速：0.6 mL·min-1；柱溫：30 ℃；進樣量：5 μL；檢測波長：265 nm。

2.1.4 指紋圖譜的建立 精密吸取核桃楸皮不同極性部位供試品溶液5 μL，按“2.1.3”項下色譜條件進樣分析,將不同極性部位的色譜圖導入到“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統”，得到核桃楸皮不同極性部位的指紋圖譜(見圖1)。將相同保留時間下的色譜峰記為同一峰號,若某部位在該保留時間下無峰,則將其峰面積記為0.01，得到各共有峰的保留時間和峰面積。從指紋圖譜中可以看出，不同極性部位的峰面積及峰數存在明顯差異，表明不同極性部位所含化學成分組成及含量有一定的差異性。

S1.乙酸乙酯提取物；S2.70%乙醇提取物；S3.正丁醇提取物；S4.氯仿提取物；S5.石油醚提取物；S6.水提取物

2.1.5 成分鑒定 按“2.1.2”項下方法制備混合對照品溶液，按“2.1.3”項下色譜條件進樣分析，得到核桃楸皮混合對照品圖譜(見圖2)。經對照品比對，指認出2號峰為沒食子酸，4號峰為丁香酸，7號峰為阿魏酸，9號峰為鞣花酸，10號峰為槲皮苷，14號峰為柚皮素，16號峰為山柰酚。

圖2 混合對照品圖

2.2 核桃楸皮不同極性部位體外藥效研究

2.2.1 含藥培養液的制備 精密稱取核桃楸皮不同極性部位提取物，加DMEM完全培養基(5‰DMSO助溶)配制成濃度為0.6 mg·mL-1的溶液，0.22 μm微孔濾膜過濾，即得。

2.2.2 不同極性部位對人肝癌HepG2細胞抑制作用 取對數生長期、生長狀態良好的人肝癌HepG2細胞，以1×105mL-1的密度接種于96孔板中，每孔100 μL，于37 ℃培養箱常規體外培養6～8 h，待細胞貼壁完全后，設不同極性部位給藥組和空白對照組，每組設5個復孔，給藥24 h后，每孔避光加入100 μL的10%CCK-8溶液，37 ℃培養箱孵育2 h后，酶標儀測定450 nm處的吸光度(OD)值，重復3次，結果見表1。與空白對照組相比，各給藥組吸光度明顯降低(P<0.01)。

表1 核桃楸皮不同極性部位對人肝癌HepG2細胞的抑制率

2.3 譜效關系研究

2.3.1 灰色關聯度分析 根據核桃楸皮不同極性部位的指紋圖譜，從中篩選出分離度、對稱因子較好的24個色譜峰。采用歸一化法對數據進行無量綱化處理，將不同極性部位對人肝癌HepG2細胞抑制作用的藥效指標作為母序列，不同極性部位的共有峰峰面積作為子序列。采用灰色關聯度分析軟件(Grey ModeLing_V3.0)進行分析,得出核桃楸皮不同極性部位色譜峰與體外藥效學評價指標之間的關聯系數(見表2)。

表2 核桃楸皮不同極性部位色譜峰峰面積及關聯系數

從表中數據可知，這24個主要色譜峰代表的化學成分對肝癌抑制作用有一定的差異性，其中相關系數大于0.7的有2、4、7、8、9、10、11、13、14、15、16、17、20號共13個色譜峰。

2.3.2 偏最小二乘回歸分析 為了進一步明確核桃楸皮化學成分和藥效之間的相關性，將相關系數大于0.7的13個色譜峰峰面積作為自變量(X)，藥效數據作為因變量(Y)，導入SIMCA 14.1軟件進行偏最小二乘回歸分析，OPLS-DA模型中R2X=0.813，模型預測參數Q2=0.913，均大于0.5，表明建立的模型有效穩定[7]。結果見圖3～4。

其中，回歸系數的正、負代表各成分對抗肝癌藥效的正相關或負相關。由圖3可知，2、4、7、8、9、10、11、13、14、15、16、17號峰與藥效呈正相關，對藥效貢獻較大。

圖3 回歸系數

變量投影(variable influence on projection,VIP)可解釋自變量對因變量的貢獻程度，VIP值越大，說明該自變量對因變量的貢獻越大，VIP>1時表示對因變量有顯著貢獻[8]。對13個色譜峰的VIP值進行分析，篩選出對核桃楸皮抗肝癌作用影響較大的色譜峰(以VIP>1為標準)有4、8、9、10、11、13、15、16號峰。

綜合回歸系數和VIP值兩個指標，明確4(丁香酸)、8、9(鞣花酸)、10(槲皮苷)、11、13、15、16(山柰酚)號峰所代表的化學成分對藥效貢獻較大，為核桃楸皮治療肝癌的藥效物質。

圖4 VIP值

2.4 體外藥效單體成分驗證研究

2.4.1 供試品溶液的制備 按“2.2.1”項下方法制備濃度為0.6 mg·mL-1的乙酸乙酯部位含藥培養液。

精密稱取丁香酸、鞣花酸、槲皮苷、山柰酚對照品適量，分別加培養液制成濃度為0.6 mg·mL-1的單體給藥溶液。

根據乙酸乙酯部位圖譜數據，計算出樣品中丁香酸、鞣花酸、槲皮苷、山柰酚的含量分別為2.11%、0.95%、2.08%、1.97%。按含量比例精密稱取4個對照品，制成濃度為0.6 mg·mL-1的混合單體配伍給藥溶液。

2.4.2 不同組分對人肝癌HepG2細胞的抑制作用 取對數生長期、生長狀態良好的人肝癌HepG2細胞，以1×105mL-1密度接種于96孔板中，每孔100 μL，于37 ℃培養箱常規體外培養6～8 h，待細胞貼壁完全后，設乙酸乙酯部位給藥組、單體成分給藥組和空白對照組，每組設5個復孔。給藥24 h后，每孔避光加入100 μL的10%CCK-8溶液，37 ℃培養箱孵育2 h后，酶標儀測定450 nm處的吸光度(OD)值，實驗重復3次，結果見表3。結果表明，4種單體成分對人肝癌HepG2細胞均有一定的抑制作用。

表3 不同組分對人肝癌HepG2細胞的抑制率

根據上述結果，按“2.4.1”項下方法將4種單體成分進行配伍驗證，細胞抑制率為71.3%，占乙酸乙酯部位藥效的76.3%。表明核桃楸皮治療肝癌的藥效是多種成分協同作用的結果，明確了這4種單體成分為核桃楸皮治療肝癌的藥效物質。

3 討論

中藥的資源豐富,從中藥中篩選出具有抗腫瘤活性成分已經變成了近幾年來研究者關注的熱點領域[9]。核桃楸皮是滿藥復方木雞顆粒中抗肝癌的重要藥材之一,現代藥理學研究表明，其具有明顯的抗肝腫瘤活性[10-14]，但其抗肝腫瘤的藥效物質基礎尚不明確。因此，本研究篩選出了核桃楸皮抗肝癌的藥效物質，為抗腫瘤藥物的臨床研發提供參考。

譜效關系是中藥藥效物質基礎的重要手段[15]。本研究采用HPLC法建立了核桃楸皮不同極性部位指紋圖譜，獲得24個共有峰。采用灰色關聯度分析法，獲得了與藥效關聯較大的13個色譜峰。由于灰色關聯度分析法僅標識成分對藥效的貢獻,而不表示其正相關或是負相關[16],因此,本研究在灰色關聯分析方法基礎上進行偏最小二乘回歸分析，獲得了抗肝癌作用較強且呈正相關的8個色譜峰，確認這8個峰所代表的化學成分為核桃楸皮治療肝癌的藥效物質。經對照品比對，指認出4號峰為丁香酸、9號峰為鞣花酸、10號峰為槲皮苷、16號峰為山柰酚。丁香酸具有抗內毒素、抗白內障、抗氧化及抗腫瘤作用[17-20]。鞣花酸具有明顯的抗肝損傷、抗腫瘤血管生成、抗氧化、抗衰老等作用[21-23]。槲皮苷具有抗心腦血管疾病、抗白內障、抗炎及抗肝損傷等作用[24-26]。山柰酚具有抗抑郁、抗腫瘤、抗炎、抗氧化等作用，可以增強抗癌活性，減少心臟毒性[27-29]。

本研究根據HPLC圖譜數據計算出了4種單體成分含量，并按含量比例配伍，進行體外藥效驗證。結果顯示，4種單體成分均有一定的藥效，單體配伍組藥效占乙酸乙酯部位藥效的71.3%，明確了這4種成分為核桃楸皮治療肝癌的藥效物質，初步揭示了核桃楸皮治療肝癌的藥效物質基礎。