痰涂片熒光染色法在老年患者呼吸道真菌感染中的應用

王艷平，鄭 鵬，田 敏，石雪艷，王靜波

航天中心醫院血液科，北京 100049

近年來，中國老齡化問題日益突出，隨著各類抗菌藥物、免疫抑制劑、激素及抗腫瘤藥物的廣泛應用，老年患者呼吸道真菌感染的發病率上升，已成為臨床值得重視的問題，因此，快速檢測出病原菌，為臨床及時提供治療依據尤為重要。目前，實驗室檢測真菌的方法主要有直接鏡檢法、血清學實驗、培養法、組織病理學檢查等。真菌培養法一直被視為診斷真菌感染的“金標準”，但真菌培養法所需時間長，臨床醫生不能及時獲取患者真菌感染的依據。近來又出現了真菌免疫熒光技術，又稱為痰涂片熒光染色法，此方法簡便快速，但在臨床實驗室并未推廣，尤其是在呼吸道真菌感染中的應用甚少[1]。本研究通過對疑似呼吸道真菌感染的老年患者的痰涂片革蘭染色法、痰涂片熒光染色法與真菌培養法檢測結果進行比較，探討痰涂片熒光染色法在老年患者呼吸道真菌感染中的應用價值，為臨床快速、準確地獲得真菌檢測結果提供依據。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取本院2021年1-12月擬診為肺部真菌感染的479例老年患者為研究對象，其中男298例，女181例；年齡65～103歲，平均(81.5±9.4)歲。

1.2方法

1.2.1痰液標本留取 患者清潔口腔后采集清晨深咳痰于無菌痰盒內，2 h內送檢。

1.2.2痰液標本合格標準 痰液直接鏡檢，要求白細胞計數在每個低倍視野中≥25個，上皮細胞在每個低倍視野中≤10個，不合格標本重新采集并送檢。

1.2.3痰涂片革蘭染色法 混勻痰液標本，涂片，干燥后火焰固定，采用革蘭染液染色后鏡檢，看到形態典型的藍黑色孢子、菌絲或假菌絲記錄為陽性。

1.2.4痰涂片熒光染色法 混勻痰液標本，涂片，自然干燥后加一滴熒光染色液(諾立清，免疫顯色試劑)，加蓋玻片，輕輕按壓，用濾紙把多余的染色液吸凈，染色時間1～2 min，使用熒光顯微鏡(型號DM500)觀察結果，看到熒光標記的孢子或菌絲即判斷為陽性。

1.2.5真菌培養法 采用常規方法將混勻的痰液標本接種在沙保羅培養基上，35 ℃培養1周，菌株的初次分離采用科瑪嘉顯色培養基和YST酵母菌鑒定卡進行常規鑒定，所有菌株采用基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(MALDI-TOF MS)儀復核鑒定，結果不一致的菌株采用核糖體DNA內轉錄間隔區序列分析的方法進行菌種鑒定。標準質控菌株為念珠菌ATCC8735。

1.3觀察指標 比較痰涂片革蘭染色法、 痰涂片熒光染色法和真菌培養法檢測結果及鏡下形態，并以真菌培養法為參考標準，比較痰涂片革蘭染色法、痰涂片熒光染色法兩種方法的靈敏度、特異度、總符合率、陽性預測值及陰性預測值。靈敏度=真陽性例數/(真陽性例數+假陰性例數)×100%；特異度=真陰性例數/(假陽性例數+真陰性例數)×100%；陰性預測值=真陰性例數/(假陰性例數+真陰性例數)×100%；陽性預測值=真陽性例數/(真陽性例數+假陽性例數)×100%；符合率=(真陰性例數+真陽性例數)/總例數×100%。

1.4統計學處理 采用SPSS22.0統計軟件進行數據處理及統計分析。計數資料以例數或百分率表示，組間比較采用χ2檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.13種方法的真菌檢測結果比較 痰涂片革蘭染色法、 痰涂片熒光染色法和真菌培養法檢出率分別為13.6%、36.5%和34.2%，差異有統計學意義(χ2=75.828，P<0.001)；痰涂片熒光染色法真菌檢出率略高于真菌培養法，但差異無統計學意義(χ2=0.552，P=0.457)； 痰涂片熒光染色法真菌檢出率高于痰涂片革蘭染色法，差異有統計學意義(χ2=67.269，P<0.001)。痰涂片革蘭染色法真菌檢出率低于真菌培養法，差異有統計學意義(χ2=56.244，P<0.001)。見表1。

表1 3種方法的真菌檢測結果比較(n=479)

2.2痰涂片熒光染色法與痰涂片革蘭染色法對真菌感染的診斷效能比較 以真菌培養法為金標準，痰涂片熒光染色法、痰涂片革蘭染色法分別與真菌培養法結果比較見表2、3。痰涂片熒光染色法的靈敏度明顯高于痰涂片革蘭染色法,而特異度卻略低于痰涂片革蘭染色法，差異有統計學意義(P<0.05)；痰涂片熒光染色法的約登指數、總符合率、陽性預測值和陰性預測值明顯高于痰涂片革蘭染色法，差異有統計學意義(P<0.05)。見表4。

表2 痰涂片熒光染色法與真菌培養法結果比較(n)

表3 痰涂片革蘭染色法與真菌培養法結果比較(n)

表4 痰涂片熒光染色法與痰涂片革蘭染色法診斷效能比較

2.3真菌培養結果 479例患者的痰液標本真菌培養共檢出164株真菌，分別是白色念珠菌107株(65.2%)，光滑念珠菌19株(11.6%)，熱帶念珠菌15株(9.1%)，曲霉菌11株(6.7%)，耳念珠菌5株(3.0%)，葡萄牙念珠菌3株(1.8%)，克柔念珠菌、特納里夫念珠菌、星狀絲孢酵母、毛霉各1株，共4株(2.4%)。

2.4痰涂片革蘭染色法和痰涂片熒光染色法鏡下形態 痰涂片革蘭染色背景呈紫紅色或粉紅色，菌絲孢子被染成藍黑色，低倍鏡(×10)下背景雜亂，孢子菌絲形態與痰液標本中脂滴、細胞碎片、植物纖維雜質的形態不好區分(圖a1)，疑似的菌絲孢子形態需在油鏡下確認，油鏡下可見菌絲孢子形態(圖a2)。痰涂片熒光染色法中的菌絲孢子在熒光顯微鏡下發出明亮的藍色熒光，背景黑色，真菌形態清晰可見(圖b1～b4)，低倍鏡(×10)下即可大致確認陰、陽性，特異性非常強(圖b1、b3),高倍鏡(×40)下觀察菌絲孢子形態(圖b2、b4)，根據孢子和菌絲的形態、大小和排列等特征可初步判斷真菌種屬，例如念珠菌具有酵母樣孢子和藕節樣假菌絲(圖b2)；曲霉菌有有隔菌絲，約45度角分枝，呈鹿角樣(圖b4)。

注：a1、a2為革蘭染色菌絲孢子；b1～b4為熒光染色菌絲孢子；b1、b2為念珠菌；b3、b4為曲霉菌；a1、b1、b3為低倍鏡(×10),b2、b4為高倍鏡(×40),a2為油鏡(×100)。

3 討 論

老年患者常伴有嚴重的基礎疾病、免疫力低下，長期使用抗菌藥物、激素及免疫抑制劑導致身體免疫功能低下，菌群失調，容易繼發真菌感染，感染部位以呼吸道占首位。患者只要存在易感因素都應進行真菌的反復檢測，如有真菌感染史應定期跟蹤監測，以便及時診斷和治療。由于病原學檢查可以為臨床診治提供有力依據，建議將真菌檢測列為常規項目[2]。本研究中痰液標本真菌檢出率為34.2%(真菌培養法)，表明真菌感染率較高，早期快速、準確檢出真菌是治療的關鍵。應用痰涂片革蘭染色法、痰涂片熒光染色法分別對479份痰涂片檢測真菌，并以真菌培養法為標準，對檢測結果進行比較，結果顯示痰涂片熒光染色法真菌檢出率略高于真菌培養法，但差異無統計學意義(P=0.457)。痰涂片革蘭染色法真菌檢出率明顯低于真菌培養法和痰涂片熒光染色法，差異有統計學意義(P<0.001)。以上結果表明痰涂片熒光染色法較痰涂片革蘭染色法的檢出率更高，可以減少漏診，痰涂片熒光染色法檢出率與真菌培養法接近，有利于患者及早診斷和治療。

以往痰涂片革蘭染色法以其操作簡單、觀察方便等優點被廣泛應用于實驗室，但其檢出率明顯低于真菌培養法[3]，痰涂片革蘭染色法常規用于痰培養前的鏡檢，一方面，痰涂片保證了痰液標本的質量，能提高痰培養的陽性率；另一方面，合格痰液標本的細菌革蘭染色涂片信息可預測培養結果[4]，本研究同樣也驗證了上述觀點，痰涂片革蘭染色法檢出率明顯低于真菌培養法，但有助于選定合格的標本。痰涂片革蘭染色法真菌檢出率非常低，筆者總結主要有以下幾方面原因：(1)痰涂片太厚，真菌孢子菌絲混雜在標本內部，染色不明顯，無法辨認；(2)實驗室所用染色儀器的影響，導致染色太淺或太深均不利于鏡下觀察；(3)低倍鏡下孢子菌絲的形態不明顯，易與植物纖維、細胞碎片混淆，油鏡觀察很難做到整片瀏覽；(4)檢測人員鏡下觀察能力不足。

近些年來，痰涂片熒光染色法逐步在國內被推廣，因其具有較高的靈敏度和特異度，越來越受到臨床實驗室的青睞。痰涂片熒光染色法所使用的免疫顯色試劑主要功能成分包括β-D-葡聚糖結合蛋白和熒光素，能特異性地結合真菌細胞壁β-D-葡聚糖和幾丁質多糖，使真菌細胞壁被雙重標記，在熒光顯微鏡紫外光(波長340～380 nm) 或者藍紫光(波長420～490 nm)特定的激發光波段下，菌絲或者孢子發出明亮的藍色熒光，在黑色背景下結構清晰、易于分辨，提高真菌的檢出率，而且實驗過程非常簡單，只需滴加一滴試劑，等待1～2 min即可鏡檢。查閱文獻發現，國內學者大多將痰涂片熒光染色法用于淺部真菌的檢測，標本類型主要為皮屑、甲屑、毛發、皮膚病理組織等，研究結果均顯示痰涂片熒光染色法是一種靈敏度高、快捷、可靠的真菌檢測方法，陽性檢出率高于常規鏡檢法[5-11]。劉鴻宇等[12]提出，痰涂片熒光染色法與痰涂片革蘭染色法相比，具有更高的靈敏度、特異度和準確度，可減少假陰性發生，降低對真菌的漏檢率，值得臨床推廣應用。本研究采用3種不同的真菌檢測方法檢測老年患者痰液標本，研究結果與上述文獻一致。痰涂片熒光染色法雖然過程簡便、快捷，具有較高的靈敏度和特異度，但熒光染色后除了真菌外，細支氣管上的彈性纖維、外源性植物纖維、脂肪滴、寄生蟲也可以發出亮藍色的熒光，需結合形態區分[13]。在熒光鏡檢實際工作中，筆者總結出一些需要注意的地方，如痰液標本一定要混勻，挑取黏性或含血絲部位，均勻涂抹在玻片上，切勿蘸取唾液或涂得太厚，以免造成假陰性結果；壓片后一定要用濾紙按壓蓋玻片吸去多余的染色劑，這樣避免痰液標本懸浮流動，可使鏡下觀察更清晰，同時也可避免液體溢出造成污染；染色后盡快讀片，以免試劑干涸熒光淬滅影響觀察；玻片上會有少量纖維雜質，同樣也會發出熒光，但沒有典型的橫隔和出芽結構，形態一般不規則，大小亮度與真菌有很大差異，一定要注意區分，避免出現假陽性結果；試劑常溫保存，避免高、低溫環境及陽光直射影響試劑效果。

痰涂片熒光染色法的特異度和靈敏度均較高，不乏導致定植真菌的檢出，因此可能導致檢出率高于真菌培養法。在臨床工作中，老年住院患者的念珠菌病發病率較高，這明顯與口腔真菌的高定植率有關，中老年住院患者口腔真菌定植檢出率最高的是白色念珠菌，占95．5%[14]。伍海英[15]在1 020份呼吸道標本中共檢測出真菌271株，主要為白色念珠菌，占檢測出的病原菌總株數的76．0%，與本院培養法檢出的白色念珠菌的比例65.3%接近。本研究中的研究對象均為65歲以上的老年人，主要癥狀以咳嗽、咳痰為主，基礎疾病較多，大部分長期使用抗菌藥物治療，很容易發生菌群失調，導致機體免疫功能低下，念珠菌可在局部大量生長繁殖，由酵母相轉為菌絲相，毒力增強，導致感染，甚至導致播散性念珠菌病，因此，定植性的真菌檢出也很重要，應根據臨床病情，結合其他檢測結果綜合診斷。

綜上所述，通過3種真菌檢測方法結果的比較，發現痰涂片熒光染色法能夠快速、準確地判斷真菌，提高了真菌檢出率，在老年患者呼吸道真菌感染的診斷中具有重要的價值，有利于患者及早診斷和治療，值得實驗室推廣應用。