2015—2020年某院CRE分布、耐藥性及碳青霉烯酶基因檢測(cè)結(jié)果分析

黃加銘，王 啟，徐玉金，孫細(xì)歡，黃東紅△

1.福建醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院微生物實(shí)驗(yàn)室，福建泉州 362300;2.北京大學(xué)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，北京 100044

近年來(lái)，碳青霉烯耐藥的革蘭陰性菌，尤其是碳青霉烯耐藥腸桿菌(CRE)在全球范圍內(nèi)迅速增長(zhǎng)，已經(jīng)成為一個(gè)嚴(yán)重的全球性公共衛(wèi)生問(wèn)題。根據(jù)美國(guó)疾病控制與預(yù)防中心(CDC)的數(shù)據(jù)，CRE耐藥率在過(guò)去十年中從1.2%上升到了4.2%[1-2],根據(jù)中國(guó)抗菌藥物監(jiān)測(cè)網(wǎng)(CHINET,www.chinets.com)的數(shù)據(jù)，肺炎克雷伯菌對(duì)美羅培南和亞胺培南的耐藥率分別從2005年的2.9%和3.0%迅速上升至2018年的26.3%和25.0%，2019—2021年的耐藥率均高于23.0%。相關(guān)研究已經(jīng)證明，碳青霉烯酶基因(包括blaKPC-2和blaNDM)的存在是中國(guó)CRE對(duì)碳青霉烯類抗菌藥物耐藥的主要機(jī)制，分別以肺炎克雷伯菌和大腸埃希菌最多見[3]。本研究對(duì)2015—2020年福建醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院(以下簡(jiǎn)稱本院)臨床分離的CRE菌株進(jìn)行耐藥性、臨床分布、主要碳青霉烯酶基因型等分析，旨在為本地區(qū)CRE感染治療和流行控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2015年1月1日至2020年12月31日本院臨床分離的對(duì)厄他培南、美羅培南或亞胺培南任意一種藥物耐藥的非重復(fù)性CRE 38株，包括肺炎克雷伯菌15株，大腸埃希菌13株，陰溝腸桿菌3株，黏質(zhì)沙雷菌3株，解鳥氨酸拉烏爾菌2株，產(chǎn)酸克雷伯菌1株，植生拉烏爾菌1株。培養(yǎng)操作嚴(yán)格按照《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》[4]進(jìn)行。

1.2儀器與試劑 microflex LRF MALDI-TOF型質(zhì)譜微生物鑒定儀(德國(guó)布魯克公司)，細(xì)菌藥敏MH培養(yǎng)基、細(xì)菌分離培養(yǎng)基由鄭州安圖生物科技有限公司提供，抗菌藥物紙片為英國(guó)Oxoid公司產(chǎn)品。陽(yáng)離子調(diào)節(jié)的MH肉湯、LB肉湯瓊脂購(gòu)自美國(guó)Becton Dickinson公司；PCR儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；PCR擴(kuò)增引物由 Invitrogen公司合成；凝膠成像儀購(gòu)自北京六一生物科技有限公司。

1.3細(xì)菌鑒定及藥敏分析 采用microflex LRF MALDI-TOF型質(zhì)譜微生物鑒定儀對(duì)細(xì)菌進(jìn)行菌種鑒定復(fù)核，質(zhì)譜鑒定分值>2.0可以鑒定到種水平，分值在1.7～2.0可以鑒定到屬水平；采用微量肉湯稀釋法檢測(cè)美羅培南、亞胺培南、厄他培南、阿米卡星、頭孢他啶、環(huán)丙沙星、米諾環(huán)素、氨曲南、頭孢吡肟、左氧氟沙星、替加環(huán)素、多黏菌素B、頭孢他啶/阿維巴坦、頭孢哌酮/舒巴坦和哌拉西林/他唑巴坦的最低抑菌濃度(MIC)，采用瓊脂稀釋法檢測(cè)磷霉素的MIC。多黏菌素和磷霉素的折點(diǎn)參照歐洲臨床微生物和感染病學(xué)會(huì)藥敏委員會(huì)(EUCAST)推薦的標(biāo)準(zhǔn)[5]。替加環(huán)素的折點(diǎn)參考美國(guó)食品和藥物管理局(FDA)推薦的標(biāo)準(zhǔn)，其他藥物折點(diǎn)參照美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(CLSI，2020)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)[6]，頭孢哌酮/舒巴坦的折點(diǎn)采用頭孢哌酮的折點(diǎn)。質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC25922。

1.4碳青霉烯酶和mcr-1基因檢測(cè) 所有的CRE菌株采用加熱煮沸法提取細(xì)菌DNA，采用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增幾種常見的碳青霉烯酶基因(blaKPC、blaNDM、blaOXA-48、blaIMP和blaVIM)[7-8]。引物由Invitrogen公司合成。PCR反應(yīng)體系體積25.0 μL，包括DNA模板3.0 μL，相應(yīng)上、下游引物(10 μmol/L)各0.2 μL，2×PCR Mix 12.5 μL，ddH2O 9.1 μL。94 ℃預(yù)變性120 s，94 ℃變性30 s，退火延伸30 s，30個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。PCR檢測(cè)多黏菌素耐藥基因mcr-1[9]。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，用紫外凝膠成像與分析系統(tǒng)觀察結(jié)果，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序采用雙向通道；并將測(cè)序結(jié)果進(jìn)行BLAST序列比對(duì)(http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/;http：//www.bldb.eu/Enzymes.php) 。

1.5同源性分析 采用多位點(diǎn)序列分型(MLST)對(duì)碳青霉烯耐藥肺炎克雷伯菌(CRKP)進(jìn)行同源性分析。擴(kuò)增肺炎克雷伯菌的7個(gè)管家基因：rpoB、gapA、mdh、pgi、phoE、infB 和tonB，PCR反應(yīng)體系同1.4，所得 PCR 產(chǎn)物送北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果于網(wǎng)站數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)(http：//www.pasteur.fr/recherche/genopole/PF8/mlst/Kpneumoniae.html)，獲取CRKP序列型別(ST型)。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用Excel 2007軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)數(shù)資料以例數(shù)或百分率表示。

2 結(jié) 果

2.1CRE菌株鑒定與分布情況 2015年1月至2020年12月本院臨床共分離出腸桿菌目細(xì)菌5 908株，其中38株為CRE菌株，總檢出率為0.6%，肺炎克雷伯菌15株,大腸埃希菌13株,其他腸桿菌目細(xì)菌10株。38株CRE經(jīng)質(zhì)譜儀鑒定，分值均>2.0。CRE主要分離自普內(nèi)科、普外科、呼吸內(nèi)科與危重癥醫(yī)學(xué)科，標(biāo)本來(lái)源主要為痰液、血液、尿液等標(biāo)本。見表1。

表1 CRE科室來(lái)源和標(biāo)本來(lái)源分布情況

2.2藥敏結(jié)果 大多數(shù)CRE菌株對(duì)頭孢他啶、頭孢吡肟、頭孢哌酮/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦和碳青霉烯類抗菌藥物耐藥性較高。CRE菌株對(duì)多黏菌素B和替加環(huán)素敏感率分別為78.95%和89.48%。對(duì)阿米卡星、磷霉素和米諾環(huán)素敏感率分別為60.53%、55.26%和44.74%，其次是氨曲南(39.47%)、頭孢他啶/阿維巴坦(28.95%)、環(huán)丙沙星(15.79%)和左氧氟沙星(15.79%)。見表2。產(chǎn)blaKPC-2、blaKPC-3的CRE對(duì)頭孢他啶/阿維巴坦100%耐藥。然而，所有產(chǎn)金屬酶的CRE對(duì)頭孢他啶/阿維巴坦都有耐藥性(MIC>64 mg/L)。

2.3碳青霉烯酶和mcr-1基因檢測(cè)結(jié)果 38株CRE中,有35株碳青霉烯酶基因陽(yáng)性和2株mcr-1基因陽(yáng)性，1株未產(chǎn)酶。碳青霉烯酶基因包括23株blaNDM(65.71%,23/35)、8株blaKPC(22.86%,8/35)、3株blaIMP(8.57%,3/35)、1株blaVIM(2.86%,1/35)，未檢測(cè)到blaOXA-48基因陽(yáng)性的菌株。CRKP中blaKPC-2檢出率最高(40.00%，6/15)，CRE中均為blaNDM-5(100.00%，13/13)。35株產(chǎn)碳青霉烯酶CRE的分布見表3。

2.4同源性分析結(jié)果 15株CRKP菌株MLST分型結(jié)果為ST11型7株(46.67%)、ST540型1株(6.67%)，ST1800型1株(6.67%)，ST2026型1株(6.67%)，ST22型1株(6.67%)，ST2666型1株(6.67%)，ST356型1株(6.67%)，ST394型1株(6.67%)，ST567型1株(6.67%)。

表2 38株CRE的藥敏試驗(yàn)結(jié)果[n(%)]

表3 35株產(chǎn)碳青霉烯酶CRE的分布

3 討 論

隨著碳青霉烯類抗菌藥物在臨床治療中的廣泛使用，CRE急劇增加。國(guó)內(nèi)多中心研究顯示，臨床上的CRE主要是肺炎克雷伯菌，其次是大腸埃希菌和陰溝腸桿菌[10-11]。與CRE感染相關(guān)的醫(yī)療風(fēng)險(xiǎn)因素包括住院時(shí)間長(zhǎng)、存在侵入性操作、使用過(guò)抗菌藥物、存在血液透析及長(zhǎng)期護(hù)理設(shè)施暴露、入住重癥監(jiān)護(hù)病房(ICU)等，還有研究發(fā)現(xiàn)服用左氧氟沙星和甲氧芐啶/磺胺甲噁唑可能增加CRE感染風(fēng)險(xiǎn)[12]。

碳青霉烯類抗菌藥物治療臨床上大多數(shù)的革蘭陰性菌有效。然而，CRE不僅對(duì)相關(guān)碳青霉烯類抗菌藥物耐藥，而且還對(duì)許多其他抗菌藥物耐藥，因此，CRE可導(dǎo)致難以治療的嚴(yán)重感染。此外，臨床上分離的CRE菌株包括大腸埃希菌、克雷伯菌腸桿菌屬、沙雷菌屬、變形桿菌屬等，這些細(xì)菌是各種感染性疾病的常見致病菌。與此同時(shí)，碳青霉烯類抗菌藥物耐藥基因通常在質(zhì)粒上，從醫(yī)院感染和公共衛(wèi)生的角度來(lái)看，更需特別關(guān)注。

CRE包括產(chǎn)生碳青霉烯酶的CRE(CP-CRE)和不產(chǎn)生碳青霉烯酶的CRE(非CP-CRE)。CP-CRE比非CP-CRE具有更高的MIC和更高的病死率。此外，碳青霉烯酶的編碼基因通常存在于可移動(dòng)的遺傳元件上，因此CP-CRE的感染控制風(fēng)險(xiǎn)可能高于非CP-CRE[13]。本院的CP-CRE占比達(dá)到92.11%(35/38)，需引起重視。

在中國(guó)，KPC-2、NDM和OXA-48型碳青霉烯酶在CRE臨床分離株中占優(yōu)勢(shì)，碳青霉烯酶基因最多見的是肺炎克雷伯菌分離株中的blaKPC-2，以及兒童大腸埃希菌分離株中的blaNDM[14]。本院尚未發(fā)現(xiàn)有兒童檢出CRE，且目前本院產(chǎn)碳青霉烯酶CRE以blaNDM為主，達(dá)到65.71%，這可能與本院檢出的CRE菌株數(shù)量較少有關(guān)，也與細(xì)菌的地域分布差異有關(guān)。本院藥敏分析結(jié)果顯示，所有產(chǎn)金屬酶的CRE對(duì)頭孢他啶/阿維巴坦都耐藥，大多數(shù)產(chǎn)金屬β-內(nèi)酰胺酶的CRE，尤其是那些產(chǎn)NDM型酶的CRE對(duì)β-內(nèi)酰胺類和大多數(shù)非β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物(氨基糖苷類、甲氧芐啶/磺胺甲噁唑、四環(huán)素、氟喹諾酮類)高度耐藥，盡管阿維巴坦對(duì)金屬酶缺乏活性，但它與氨曲南在少數(shù)體外和動(dòng)物研究中顯示出協(xié)同效應(yīng)[15]，且這種聯(lián)合應(yīng)用需要在臨床實(shí)踐中進(jìn)一步評(píng)估。最近開發(fā)的氨曲南/阿維巴坦(ATM-AVI)組合用藥方案提供了一種新的治療選擇[16]，然而，相關(guān)研究揭示了多種產(chǎn)生NDM-5的大腸埃希菌分離株具有不同的克隆背景，表現(xiàn)出對(duì)ATM-AVI的MIC升高，并已在全球傳播(瑞士、巴基斯坦、印度、科威特、泰國(guó)、土耳其、哥倫比亞、委內(nèi)瑞拉和美國(guó))[17]，主要原因是產(chǎn)NDM-5大腸埃希菌的質(zhì)粒都攜帶有blaCMY β-內(nèi)酰胺酶基因，其中blaCMY-42等位基因占優(yōu)勢(shì)[18]。

本研究結(jié)果顯示，在15株CRKP中，主要以blaKPC為主，占53.33%(8/15)，與國(guó)內(nèi)研究基本一致[14]。而丹麥檢出的在CRKP中主要以blaOXA-48為主[19]。本研究結(jié)果顯示15株CRKP菌株MLST分型主要以ST11型為主(46.67%)，ST11型高致病性肺炎克雷伯菌菌株對(duì)人類健康構(gòu)成重大威脅，因?yàn)樗鼈兺瑫r(shí)具有高致病性、多藥耐藥性和高度傳染性。因此，應(yīng)采取控制措施，防止CRKP在醫(yī)院環(huán)境和社區(qū)中進(jìn)一步傳播[20]。

本研究結(jié)果顯示，大多數(shù)CRE菌株對(duì)常用抗菌藥物表現(xiàn)出高度耐藥性，潛在有用的藥物是替加環(huán)素、多黏菌素B、阿米卡星和磷霉素。本院在2015—2020年共檢出5株對(duì)多黏菌素B耐藥的CRE菌株，其中2株產(chǎn)mcr-1基因，有研究顯示目前我國(guó)產(chǎn)mcr-1的肺炎克雷伯菌為0.11%[21]，美國(guó)首次在耐多藥大腸埃希菌中發(fā)現(xiàn)了質(zhì)粒介導(dǎo)的多黏菌素耐藥性，這引起了對(duì)泛耐藥細(xì)菌的擔(dān)憂[22]。多黏菌素(黏菌素和多黏菌素B)被認(rèn)為是治療CRE感染的最后選擇。盡管沒(méi)有多黏菌素暴露，但臨床CRE分離株仍存在多黏菌素耐藥性。藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，我國(guó)多黏菌素的耐藥率為3.8%[23]。隨著新的β-內(nèi)酰胺/β-內(nèi)酰胺酶抑制劑的引入，患者有了更多的選擇方案，避免使用多黏菌素而引起相關(guān)的不良反應(yīng)[24]。對(duì)于一種或多種抗菌藥物仍具有活性的CRE菌株，大多數(shù)菌株使用聯(lián)合治療能取得良好的效果，經(jīng)常使用的方案包括碳青霉烯類、多黏菌素、氨基糖苷類或替加環(huán)素等抗菌藥物的組合[25]。

臨床微生物實(shí)驗(yàn)室的工作人員在預(yù)防CRE傳播和協(xié)助患者治療方面發(fā)揮著重要作用，實(shí)驗(yàn)室人員應(yīng)能夠提供準(zhǔn)確的藥敏試驗(yàn)結(jié)果，應(yīng)提供CRE的相關(guān)酶型檢測(cè)結(jié)果，必要時(shí)應(yīng)該加做個(gè)體化聯(lián)合藥敏試驗(yàn)，同時(shí)結(jié)合各地區(qū)各醫(yī)院的數(shù)據(jù)，合理使用抗菌藥物。總之，本院的CRE總體分離率不高，本院尚未發(fā)現(xiàn)有兒童CRE菌株，且目前本院成人的CRE以blaNDM為主，未發(fā)現(xiàn)有CRE克隆菌株暴發(fā)流行，但本研究樣本量較小，后期需要再進(jìn)一步分析。