宮頸鱗狀細(xì)胞癌中SMC4、CTLA4表達(dá)情況及其早期診斷價(jià)值

高婷婷，王兆林,師增增，李雪峰，梁 立△，王 麗

1.中國(guó)人民解放軍空軍軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院婦產(chǎn)科，陜西西安 710038；2.西安醫(yī)學(xué)院，陜西西安 710077

宮頸癌是全世界范圍內(nèi)發(fā)病率較高的女性惡性腫瘤，發(fā)病率高居世界女性惡性腫瘤第2位，僅次于乳腺癌[1]。我國(guó)宮頸癌患病人數(shù)占全世界患病人數(shù)的33%，病死人數(shù)占全世界因?qū)m頸癌病死人數(shù)的11.30%，嚴(yán)重威脅女性的生命健康[2]。宮頸鱗狀細(xì)胞癌是宮頸癌的主要發(fā)病類型，約占宮頸癌的95%，盡管目前醫(yī)學(xué)技術(shù)飛速發(fā)展，但宮頸鱗狀細(xì)胞癌的有效篩查及早期診斷情況仍不盡人意[3-4]。染色體結(jié)構(gòu)維持蛋白4(SMC4)是染色體ATP酶超家族成員之一，近年研究發(fā)現(xiàn)，SMC4在宮頸癌組織中異常表達(dá)，認(rèn)為SMC4過表達(dá)可通過激活NF-κB通路促進(jìn)宮頸癌的發(fā)展[5]。細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4(CTLA4)是存在于活化T及B淋巴細(xì)胞表面的一種跨膜蛋白，可介導(dǎo)T淋巴細(xì)胞增殖及分化過程，幫助腫瘤細(xì)胞脫離免疫監(jiān)視，從而參與多種惡性腫瘤的發(fā)生及發(fā)展[6-7]。本研究觀察分析了宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中SMC4、CTLA4表達(dá)變化及其早期診斷價(jià)值，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2016年1月至2017年1月中國(guó)人民解放軍空軍軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院(以下簡(jiǎn)稱本院)收治的112例早期宮頸鱗狀細(xì)胞癌患者為觀察組，其中國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(FIGO)宮頸癌分期ⅠB1期69例(61.61%)，ⅡA期43例(38.39%)；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移42例(37.50%)，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移70例(62.50%)；腫瘤最大徑<4 cm 62例(55.36%)，腫瘤最大徑≥4 cm 50例(44.64%)；組織分化程度為低分化49例(43.75%)，中高分化63例(56.25%)。(1)納入標(biāo)準(zhǔn)：①所有患者均符合《婦產(chǎn)科學(xué)》[8]中宮頸鱗狀細(xì)胞癌診斷標(biāo)準(zhǔn)，且經(jīng)病理檢查確診；②首次診斷，F(xiàn)IGO分期為ⅠA～ⅡB期，既往未進(jìn)行放化療；③依從性良好，可配合檢查及治療。(2)排除標(biāo)準(zhǔn)：①重要器官存在嚴(yán)重功能障礙；②哺乳期或妊娠期女性；③合并宮頸相關(guān)疾病；④年齡>70歲。選擇同期140例懷疑宮頸疾病于本院進(jìn)行病理檢查的女性為對(duì)照組，均排除宮頸癌。所有研究對(duì)象均簽署知情同意書，本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2方法

1.2.1臨床資料收集 收集各組受檢者流產(chǎn)史、絕經(jīng)情況、首次性交年齡、首次生育年齡、孕次、婦科疾病史、家族腫瘤史、飲酒、吸煙、年齡、民族、婚姻狀態(tài)等臨床資料。

1.2.2血清指標(biāo)檢測(cè) 采集兩組受檢者清晨空腹靜脈血，3 000 r/min離心10 min，收集血清標(biāo)本于—40 ℃低溫冰箱中保存待測(cè)，避免反復(fù)凍融。采用羅氏Cobas 6000化學(xué)發(fā)光分析儀檢測(cè)糖類抗原(CA)125、CA199、癌胚抗原(CEA)、人附睪蛋白-4(HE4)水平。

1.2.3免疫組化法檢測(cè)SMC4及CTLA4 取各組受檢者宮頸組織標(biāo)本，10%甲醛固定后石蠟包埋，制成石蠟切片，厚度為4 μm，恒溫箱烤片30 min，切片抗原修復(fù)，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次，3%過氧化氫滴加于切片中，室溫下孵育15 min，PBS沖洗3次，山羊血清封閉30 min，滴加SMC4、CTLA4一抗(SMC4一抗購于上海優(yōu)寧維生物科技股份有限公司，CTLA4一抗購于武漢博歐特生物科技有限公司)，4 ℃恒溫箱中孵育15 h，PBS沖洗3次，滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗山羊IgG二抗(購于北京博爾西科技有限公司)室溫孵育20 min，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色蘇木素復(fù)染1 min，1%鹽酸酒精分化，PBS水洗反藍(lán)，脫水透明后封膠，顯微鏡下觀察各組宮頸組織著色強(qiáng)度。高倍視野下判斷染色強(qiáng)度及陽性率：不著色為0分，黃色為1分，棕黃色為2分，黃褐色為3分。陽性細(xì)胞率記分：0分為陽性細(xì)胞≤5%，1分為>5%～25%；2分為>25%～50%；3分為>50%～75%；4分為>75%。陰性為兩種積分之和為0～1分，弱陽性為2分，陽性為3～4分，強(qiáng)陽性為5分及以上。0～2分為低表達(dá)，3分及以上為高表達(dá)。根據(jù)SMC4表達(dá)評(píng)分分為SMC4高表達(dá)組(SMC4表達(dá)評(píng)分≥3分)及SMC4低表達(dá)組(SMC4表達(dá)評(píng)分<3分)，根據(jù)CTLA4表達(dá)評(píng)分分為CTLA4高表達(dá)組(CTLA4表達(dá)評(píng)分≥3分)及CTLA4低表達(dá)組(CTLA4表達(dá)評(píng)分<3分)。

1.2.4隨訪評(píng)估 通過電話及復(fù)診隨訪所有宮頸鱗狀細(xì)胞癌患者，隨訪日期截至2021年1月31日，記錄并比較不同SMC4及CTLA4表達(dá)情況患者的生存周期。

2 結(jié) 果

2.1兩組各項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)及臨床資料比較 與對(duì)照組比較，觀察組宮頸組織SMC4及CTLA4表達(dá)評(píng)分、CA125、HE4、CA199、CEA水平明顯升高，同時(shí)觀察組有流產(chǎn)史、已絕經(jīng)、首次性交年齡<20歲、首次生育年齡<20歲、孕次>5次、有婦科疾病史患者比例均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。SMC4及CTLA4免疫組化染色結(jié)果見圖1、2。

表1 兩組各項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)及臨床資料比較或n(%)]

組別n民族漢族其他婚姻狀態(tài)已婚離婚、喪偶流產(chǎn)史無有對(duì)照組140120(85.71)20(14.29)124(88.57)16(11.43)80(57.14)60(42.86)觀察組11298(87.50)14(12.50)92(82.14)20(17.86)30(26.79)82(73.21)t/χ20.1702.10023.312P0.6800.147<0.001

組別n絕經(jīng)是否首次性交年齡(歲)<2020～<25≥25首次生育年齡(歲)<2020～<25≥25對(duì)照組14052(37.14)88(62.86)24(17.14)48(34.29)68(48.57)32(22.86)68(48.57)40(28.57)觀察組11270(62.50)42(37.50)46(41.07)36(32.14)30(26.79)56(50.00)40(35.71)16(14.29)t/χ216.01920.50521.242P<0.001<0.001<0.001

續(xù)表1 兩組各項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)及臨床資料比較或n(%)]

組別n吸煙是否飲酒是否家族腫瘤史有無對(duì)照組14020(14.29)120(85.71)16(11.43)124(88.57)32(22.86)108(77.14)觀察組11214(12.50)98(87.50)16(14.29)96(85.71)20(17.86)92(82.14)t/χ20.1700.4580.950P0.6800.4980.330

注：A為對(duì)照組宮頸組織SMC4免疫組化染色圖片；B為觀察組宮頸組織SMC4免疫組化染色圖片。

注：A為對(duì)照組宮頸組織CTLA4免疫組化染色圖片；B為觀察組宮頸組織CTLA4免疫組化染色圖片。

2.2影響宮頸鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生的危險(xiǎn)因素分析 多因素Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)，SMC4高表達(dá)、CTLA4高表達(dá)、有流產(chǎn)史、已絕經(jīng)、首次性交年齡<20歲、首次生育年齡<20歲、孕次>5次、有婦科疾病史，以及CA125、HE4、CA199、CEA水平升高均為宮頸鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生的危險(xiǎn)因素(P<0.05)。見表2。

表2 影響宮頸鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生的危險(xiǎn)因素分析

續(xù)表2 影響宮頸鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生的危險(xiǎn)因素分析

2.3不同SMC4、CTLA4表達(dá)情況患者生存曲線分析 56例宮頸鱗狀細(xì)胞癌患者成功隨訪，平均隨訪時(shí)間為34個(gè)月(5～60個(gè)月)，Kaplan-Meier生存曲線分析結(jié)果顯示，SMC4高表達(dá)患者(26例)總生存率為61.54%(16/26)，明顯低于SMC4低表達(dá)患者(30例)的80.00%(24/30)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。CTLA4高表達(dá)患者(28例)的總生存率為60.71%(17/28)，明顯低于CTLA4低表達(dá)患者(28例)的82.14%(23/28)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖3。

注：A為不同SMC4表達(dá)情況患者生存曲線；B為不同CTLA4表達(dá)情況患者生存曲線。

2.4SMC4、CTLA4診斷宮頸鱗狀細(xì)胞癌的價(jià)值分析 ROC曲線分析發(fā)現(xiàn)，SMC4、CTLA4診斷宮頸鱗狀細(xì)胞癌的AUC分別為0.715、0.752，SMC4+CTLA4診斷宮頸鱗狀細(xì)胞癌的AUC為0.875，二者聯(lián)合診斷宮頸鱗狀細(xì)胞癌的AUC明顯大于SMC4、CTLA4單獨(dú)檢測(cè)(Z=5.714、3.075，P<0.05)。見表3、圖4。

表3 SMC4、CTLA4診斷宮頸鱗狀細(xì)胞癌的價(jià)值分析

圖4 SMC4、CTLA4診斷宮頸鱗狀細(xì)胞癌的ROC曲線

3 討 論

宮頸鱗狀細(xì)胞癌是全世界范圍內(nèi)常見的女性惡性腫瘤，近年統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，全世界每年有50萬人確診為宮頸鱗狀細(xì)胞癌，其中發(fā)展中國(guó)家的人數(shù)占90%以上[9]。隨著近年生活節(jié)奏的加快及生活壓力的增加，宮頸鱗狀細(xì)胞癌患病率不斷增加，且呈現(xiàn)年輕化趨勢(shì)，成為醫(yī)學(xué)界關(guān)注的焦點(diǎn)。目前，臨床治療宮頸鱗狀細(xì)胞癌的主要方式為手術(shù)治療，但由于宮頸鱗狀細(xì)胞癌早期癥狀不典型，多數(shù)患者確診時(shí)已處于中晚期，耽誤手術(shù)治療的最佳時(shí)機(jī)，預(yù)后情況較差[10-11]，因此，尋找有效篩查及早期診斷宮頸鱗狀細(xì)胞癌的方法成為婦科領(lǐng)域關(guān)注熱點(diǎn)。

SMC4是近年研究惡性腫瘤的常見因子，可通過調(diào)控染色體的聚合及分離過程介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的增殖及遷移過程[12-13]。目前研究發(fā)現(xiàn)SMC4在乳腺癌、肝癌、胰腺癌、結(jié)腸癌等多種惡性腫瘤組織中呈明顯高表達(dá)，具有一定致癌性，通過參與腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移過程促進(jìn)腫瘤的發(fā)展[14]。宿主免疫系統(tǒng)變化影響著腫瘤的發(fā)生及發(fā)展進(jìn)程，CTLA4作為一種跨膜蛋白，可通過調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞的增殖及活化過程抑制機(jī)體的免疫應(yīng)答，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移及侵襲。目前研究發(fā)現(xiàn)，CTLA4在膽管癌、乳腺癌及鼻咽癌等多種惡性腫瘤中明顯高表達(dá)，且其水平越高，患者預(yù)后情況越差[15-16]。近年研究發(fā)現(xiàn)，CTLA4在宮頸癌中呈異常表達(dá)狀態(tài)，可能參與宮頸癌的發(fā)生及發(fā)展[17]。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，觀察組宮頸組織SMC4、CTLA4表達(dá)評(píng)分明顯升高。這提示SMC4、CTLA4的表達(dá)可能與宮頸鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生及發(fā)展存在密切聯(lián)系，與林瑤等[18]研究中SMC4作為促癌基因促進(jìn)宮頸鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生的結(jié)論相近。究其原因，可能與SMC4通過介導(dǎo)染色體形態(tài)變化調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖過程有關(guān)。同時(shí)本研究采用多因素Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)，SMC4高表達(dá)、CTLA4高表達(dá)、有流產(chǎn)史、已絕經(jīng)、首次性交年齡<20歲等因素為影響宮頸鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生的危險(xiǎn)因素。Kaplan-Meier生存曲線分析發(fā)現(xiàn)，SMC4高表達(dá)患者總生存率明顯低于SMC4低表達(dá)患者，CTLA4高表達(dá)患者總生存率明顯低于CTLA4低表達(dá)患者。由此說明，SMC4、CTLA4兩指標(biāo)的高表達(dá)與宮頸鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生及預(yù)后情況密切相關(guān)。進(jìn)一步分析SMC4、CTLA4在早期診斷宮頸鱗狀細(xì)胞癌中的價(jià)值，發(fā)現(xiàn)SMC4、CTLA4診斷宮頸鱗狀細(xì)胞癌的AUC分別為0.715、0.752，二者聯(lián)合診斷宮頸鱗狀細(xì)胞癌的AUC為0.875。這提示SMC4、CTLA4在診斷宮頸鱗狀細(xì)胞癌方面具有一定價(jià)值，其中相較于單一指標(biāo)，二者聯(lián)合診斷價(jià)值更高，有助于宮頸鱗狀細(xì)胞癌的有效篩查及早期診斷，改善患者預(yù)后。

綜上所述，SMC4、CTLA4在宮頸鱗狀細(xì)胞癌中表達(dá)明顯上調(diào)，可能參與宮頸鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生及發(fā)展過程，可作為宮頸鱗狀細(xì)胞癌的早期診斷生物學(xué)標(biāo)志物，二者水平升高可能預(yù)示著預(yù)后不良。