結直腸癌患者血清lncRNA SNHG11及miRNA-27b水平分析及與預后的關系*

陳毅聰,尚爾波,侯園婷,敖 俞

廣州市增城區中醫醫院：1.檢驗科;2.腫瘤科,廣東廣州 511300;3.廣州市番禺區中心醫院腫瘤科，廣東廣州 511400

結直腸癌是一類常見的消化道惡性腫瘤疾病，其發病率及病死率均居惡性腫瘤前列，且隨著社會的發展，結直腸癌的發病率呈逐年上升趨勢[1-2]。早期結直腸癌的臨床癥狀并不明顯，多數患者確診時已進展為中晚期，雖然結直腸癌的診斷、治療已取得較大進展，但研究表明，結直腸癌患者5年生存率仍不足50%，而且約有40%患者會出現轉移或復發[3-5]。因此，研究結直腸癌生物標志物對疾病的診斷和治療具有十分重要的意義。長鏈非編碼RNA(lncRNA)是一類長度為200～300 bp的非編碼RNA分子，其可調節組蛋白的修飾、蛋白質功能活性以及染色體重塑等，并通過轉錄、轉錄后調控以及表觀遺傳等過程調控基因的表達[6-7]。已有研究證實，lncRNA可參與機體多種生理、病理過程，并在癌細胞的生長、增殖中發揮重要作用[8]。lncRNA小核RNA宿主基因11(SNHG11)屬lncRNA家族成員之一，位于人類染色體20q11.23上。既往關于lncRNA SNHG11在結直腸癌中表達的研究多集中于組織標本[9]，關于其在血清中的水平及與患者臨床特征關系的報道較少。微小RNA(miRNA)是一類內源性非編碼小RNA分子，其主要通過抑制作用調節機體基因表達。miRNA在細胞增殖、凋亡、分化等過程中發揮著重要作用。研究表明，miR-27b與多種腫瘤的發生、發展密切相關，但其在結直腸癌發生、發展中的表達情況尚未明確[10]。基于此，本研究對結直腸癌患者血清lncRNA SNHG11、miR-27b水平進行分析，并研究這兩項指標與結直腸癌患者預后的關系，旨在為結直腸癌的診斷、治療及預后評估提供新的思路。

1 資料與方法

1.1一般資料 將2016年1月至2018年1月廣州市增城區中醫醫院收治的94例結直腸癌患者納入研究作為結直腸癌組，男55例、女39例，年齡(58.4±5.6)歲；將同期于本院就診的94例結直腸良性疾病患者納入研究作為結直腸癌良性疾病組，男58例、女36例，年齡(58.1±6.2)歲；另外，選取94例體檢健康者作為對照組，男50例、女44例，年齡(57.9±6.8)歲。所有納入研究者均對本研究知情同意并簽署知情同意書。本研究經醫院倫理委員會批準。

1.2納入及排除標準 結直腸癌組納入標準：(1)經病理學檢查確診為結直腸癌；(2)既往無手術史；(3)擬行外科手術治療；(4)術前未行放化療；(5)年齡≥18歲。結直腸良性疾病組納入標準：(1)確診為炎性疾病、損傷性疾病或非腫瘤的息肉性疾病等結直腸良性疾病；(2)既往無手術史；(3)年齡≥18歲。對照組納入標準：(1)近1個月內體檢健康；(2)年齡≥18歲。排除標準：(1)有其他系統或組織的惡性腫瘤；(2)合并感染性疾病、心肺功能障礙性疾病等其他嚴重疾病；(3)近6個月服用過免疫功能調節藥物等可能影響實驗結果的藥物；(4)依從性差；(5)處于妊娠期或哺乳期；(6)同時參加了其他研究項目。

1.3方法

1.3.1指標的檢測 所有納入研究者于入組時抽取靜脈血5 mL，以3 000 r/min離心5 min，分離血清，根據RNA提取試劑盒說明書提取血清RNA，并根據反轉錄試劑盒進行反轉錄，采用SYBR 實時熒光定量聚合酶鏈反應(qPCR)試劑盒(中國杭州博日科技有限公司)進行qPCR檢測。PCR反應條件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 10 s，60 ℃ 1 min，循環40次。采用2-ΔΔCt法計算各組lncRNA SNHG11、miR-27b相對表達水平，內參為U6，每個標本重復檢測3次，取平均值。引物由中國北京鼎國生物科技有限公司合成，序列見表1。

表1 引物序列

1.3.2觀察指標 (1)比較結直腸癌組、結直腸良性疾病組及對照組血清lncRNA SNHG11、miR-27b水平；(2)以結直腸癌患者lncRNA SNHG11、miR-27b水平平均值為界將患者分為高表達組和低表達組，隨訪3年，采用K-M生存曲線分析兩組患者累積存活率。(3)根據結直腸癌組患者年齡、性別、有無淋巴結轉移、有無遠處轉移、病理類型、TNM分期、腫瘤最大徑及分化程度將其分為不同亞組，比較亞組間lncRNA SNHG11、miR-27b水平；(4)采用受試者工作特征(ROC)曲線分析lncRNA SNHG11、miR-27b水平用于評估患者生存預后的價值；(3)根據隨訪3年后患者是否存活，將其分為存活組和死亡組，比較兩組患者的血清lncRNA SNHG11、miR-27b水平。

2 結 果

2.13組血清lncRNA SNHG11、miR-27b水平比較 相較于結直腸良性疾病組及對照組，結直腸癌組血清lncRNA SNHG11水平更低(P<0.05)，而miR-27b水平更高(P<0.05)，見表2。

表2 3組血清lncRNA SNHG11、miR-27b水平比較

2.2不同臨床特征結直腸癌患者血清lncRNA SNHG11、miR-27b水平比較 相較于無淋巴結轉移或TNM分期為Ⅰ～Ⅱ期患者，有淋巴結轉移或TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期患者血清lncRNA SNHG11水平更低(P<0.05)，而miR-27b水平更高(P<0.05)，見表3。

表3 不同臨床特征結直腸癌患者血清lncRNA SNHG11、miR-27b水平比較

續表3 不同臨床特征結直腸癌患者血清lncRNA SNHG11、miR-27b水平比較

2.3存活組和死亡組lncRNA SNHG11、miR-27b水平比較 存活組lncRNA SNHG11、miR-27b相對表達水平分別為4.16±0.40、3.52±0.35，死亡組lncRNA SNHG11、miR-27b相對表達水平分別為3.53±0.35、4.08±0.37，兩組比較差異均有統計學意義(t=8.150、7.384，P<0.001)。

2.4lncRNA SNHG11、miR-27b水平用于評估結直腸癌患者生存預后的價值 ROC曲線分析顯示：lncRNA SNHG11用于評估患者生存預后的最佳截斷值為3.883，曲線下面積(AUC)為0.868；miR-27b用于評估患者生存預后的最佳截斷值為3.971，AUC為0.851，見表4。

表4 lncRNA SNHG11、miR-27b水平用于評估結直腸癌患者生存預后中的價值

2.5lncRNA SNHG11高表達組及低表達組累積存活率的比較 隨訪3年，lncRNA SNHG11高表達組(54例)中36例存活，累積生存期為32.99(32.12，33.86)個月，累積存活率為66.67%，lncRNA SNHG11低表達組(40例)中16例存活，累積生存期為26.93(25.35，28.50)個月，累積存活率為40.00%，兩組累積存活率比較差異有統計學意義(logrankχ2=26.438，P<0.05)。

2.6miR-27b高表達組及低表達組累積存活率比較 隨訪3年，miR-27b高表達組(43例)中18例存活，累積生存期為33.16(32.21，34.10)個月，累積存活率為41.86%，miR-27b低表達組(51例)中34例存活，累積生存期為27.50(25.89，29.12)個月，累積存活率為66.67%，兩組累積存活率比較差異有統計學意義(logrankχ2=27.198，P<0.05)。

3 討 論

雖然結直腸癌的早期檢出率已有所提高，并為手術根治提供了時間窗口，但仍有一定比例的患者死于復發或者轉移。目前臨床上針對結直腸癌的診斷及評估病情的方法包括篩查試驗、結腸鏡檢查、直腸指檢、糞便隱血檢查、雙重對比劑鋇灌腸造影、組織病理學檢查等，其中診斷的金標準為結腸鏡檢查聯合組織病理檢查。“金標準”采用的檢查方法具有較高的靈敏度和特異度，有助于醫師在疾病進展前期進行根治治療[11]，但均包含了侵入性操作且花費較高，導致患者依從性較差。而其他幾類方法雖操作簡便、成本較低，但因靈敏度和特異度不高，應用受限。因此尋找一種容易檢測、靈敏度高的生物學標志物具有十分重要的意義。

既往的研究表明，結腸上皮細胞中的遺傳以及表觀遺傳學變化的累積是促進結直腸癌發生、發展的因素[12-13]。隨著分子生物學的發展，lncRNA與腫瘤的關系逐漸受到廣大醫學研究者的關注，研究取得一定進展[14-17]。大量lncRNA參與了結直腸癌的發生、發展過程，并發揮重要作用[12]。lncRNA CCAT1在結直腸癌發生的早期階段已有所升高，患者血標本中其水平也有所升高[18]。TAKAHASHI等[19]的研究發現，lncRNA PVT-1可對TGF-β信號通路以及調亡信號產生抑制作用，進而促進結直腸癌的發生發展，并提示lncRNA PVT-1可作為評估結直腸癌患者預后指標之一。SNHG11為小核RNA宿主基因(SNHGs)之一，既往有研究報道，其在結直腸癌組織中的表達水平與淋巴結轉移、TNM分期、遠處轉移密切相關[20]。XU等[21]的研究則提示，血漿lncRNA SNHG11可作為結直腸癌早期診斷及預后評估的生物學標志物。本研究則采用較易獲得的血清作為檢測標本。結果顯示，相較于結直腸良性疾病患者或健康者，結直腸癌患者血清lncRNA SNHG11水平有所下降。進一步根據患者臨床特征進行亞組分析，結果顯示，相較于無淋巴結轉移或TNM分期為Ⅰ～Ⅱ期患者，有淋巴結轉移或TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期患者血清lncRNA SNHG11水平更低(P<0.05)。這與既往研究結果較為一致[21]，但本研究結果發現血清lncRNA SNHG11水平在有/無遠處轉移的亞組間比較差異無統計學意義(P>0.05)，這可能與標本來源不同、檢測方式不同有關。

miRNAs是一類長度為17～25個核苷酸的非編碼RNA，其不能編碼蛋白質，主要作用機制為通過與靶基因的3′端非翻譯區相結合從而對靶基因的表達進行抑制，miRNA在疾病的發生發展、過程中發揮著關鍵作用[22]。miR-27b位于人9號染色體上，miR-27b在多種腫瘤組織中存在異常表達，miR-27b可能參與癌癥的發生、發展[23]。本研究結果顯示，相較于結直腸良性疾病患者或健康人群，結直腸癌患者血清miR-27b水平顯著升高。進一步根據患者臨床特征進行亞組分析，結果顯示，相較于無淋巴結轉移或TNM分期為Ⅰ～Ⅱ期患者，有淋巴結轉移或TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期患者血清miR-27b水平更高，這提示miR-27b表達水平與結直腸癌患者病情存在一定聯系。

本研究還通過ROC曲線分析了血清lncRNA SNHG11、miR-27b水平用于評估結直腸癌患者生存預后的價值。結果顯示，lncRNA SNHG11的最佳截斷值為3.883，AUC為0.868；miR-27b的最佳截斷值為3.971，AUC為0.851；上述兩項指標均具有較高的靈敏度和特異度。隨訪結果顯示，相較于lncRNA SNHG11低表達或miR-27b高表達患者，lncRNA SNHG11高表達或miR-27b低表達患者累積存活率更高，說明血清lncRNA SNHG11水平較低或miR-27b水平較高患者預后較差。

本研究也存在以下不足：(1)為單中心研究，樣本量較小；(2)未進一步分析血清lncRNA SNHG11水平與患者病理組織lncRNA SNHG11表達的相關性，難以從分子生物學角度進行分析。

綜上所述，結直腸癌患者血清lncRNA SNHG11水平有所下降，而miR-27b水平有所上升，其水平在診斷患者淋巴結轉移、TNM分期中具有一定價值，并可作為輔助指標用于評估患者預后。