腦脊液標(biāo)志物在中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤診斷和預(yù)測中的研究進展*

彭 余，冉隆榮，李 蓮，趙明宇，羅 欣，陳 雙，張 偉 綜述，楊再林 審校

重慶大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院血液腫瘤中心，重慶 400030

中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤(CNSL)主要為侵襲性腫瘤，包括原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤(PCNSL)和繼發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤(SCNSL)兩種臨床亞型。PCNSL是一種高侵襲性的結(jié)外非霍奇金淋巴瘤，主要類型為原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤；SCNSL主要為侵襲性淋巴瘤，累及中樞神經(jīng)系統(tǒng)，常見的有彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤(DLBCL)、伯基特淋巴瘤和淋巴母細(xì)胞淋巴瘤[1-2]。患者一旦發(fā)生淋巴瘤中樞神經(jīng)系統(tǒng)浸潤后預(yù)后差，病死率高。目前，腦組織活檢雖是診斷CNSL的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但存在發(fā)生手術(shù)并發(fā)癥的風(fēng)險，而且易出現(xiàn)誤診、漏診現(xiàn)象；臨床影像學(xué)檢查診斷淋巴瘤中樞神經(jīng)浸潤存在假陽性、假陰性的結(jié)果，而且早期淋巴瘤中樞神經(jīng)系統(tǒng)浸潤的患者大多無明顯臨床表現(xiàn)。中樞神經(jīng)淋巴瘤的早期識別與診斷仍是臨床和實驗室診斷的難點。腦脊液標(biāo)本因具有獲取方便、能動態(tài)監(jiān)測疾病進展及變化的特點，已經(jīng)成為診斷CNSL常用檢測樣本。研究證實，腦脊液的流式細(xì)胞免疫分型、細(xì)胞因子和基因檢測等可用于CNSL的早期診斷及風(fēng)險評估[3]。本文就腦脊液相關(guān)指標(biāo)在診斷和預(yù)測CNSL中的研究進展作一綜述。

1 流式細(xì)胞免疫分型

流式細(xì)胞免疫分型是運用不同的流式抗體組合，對腦脊液中淋巴瘤細(xì)胞表達的標(biāo)志物進行分析，確定腫瘤細(xì)胞的類型及階段，實現(xiàn)對疾病的診斷與監(jiān)測。PCNSL起源于晚期生發(fā)中心的B淋巴細(xì)胞，腫瘤細(xì)胞主要表達B淋巴細(xì)胞標(biāo)記，而SCNSL的腫瘤細(xì)胞標(biāo)志物主要取決于浸潤而來的腫瘤細(xì)胞類型。在正常腦脊液中，大部分細(xì)胞由CD3+的T淋巴細(xì)胞組成。正常的T細(xì)胞同時表達T細(xì)胞受體β鏈恒定區(qū)1(TRBC1)和T細(xì)胞受體β鏈恒定區(qū)2(TRBC2)；而腫瘤性T細(xì)胞只表達一個β鏈恒定區(qū)，即只表達TRBC1或TRBC2[4]。當(dāng)CNSL來源于T細(xì)胞時，可以通過流式檢測TRBC1及免疫表型來診斷淋巴瘤的中樞神經(jīng)浸潤。當(dāng)CNSL來源于B細(xì)胞時，為單克隆B細(xì)胞，即CD19+的B淋巴細(xì)胞表現(xiàn)為輕鏈限制性(κ∶λ小于1∶3或大于3∶1)，并同時檢測到B細(xì)胞其他的表型異常；而正常B細(xì)胞為多克隆，即無輕鏈限制性，無表型異常。為了更好鑒定腦脊液中的淋巴瘤細(xì)胞，推薦采用單管8色12種抗體組合的染色方案，使各類細(xì)胞可以清晰分群，通過直接標(biāo)記CD45、CD8、CD20、CD4、CD56、CD5、CD19、SmIgκ、SmIgλ、TCRγδ、SmCD3、CD38等標(biāo)志物對各類細(xì)胞進行分析[5]。相較于腦脊液細(xì)胞學(xué)檢查，腦脊液流式細(xì)胞免疫分型對診斷和監(jiān)測CNSL具有更高的敏感性[6-7]，但也存在一定的不足，如腦脊液標(biāo)本中細(xì)胞數(shù)量少、壽命短，操作過程容易污染導(dǎo)致結(jié)果假陽性等[8]。

2 細(xì)胞因子檢測

2.1白細(xì)胞介素(IL)-10 在淋巴瘤發(fā)生、發(fā)展過程中，IL-10主要參與B淋巴細(xì)胞的生長和分化。NGUYEN-THEM等[9]發(fā)現(xiàn)，腦脊液IL-10的水平可用于區(qū)分PCNSL與其他神經(jīng)疾病，當(dāng)腦脊液IL-10水平臨界值為4 pg/mL時診斷PCNSL的靈敏度為88.6%，特異度為88.9%。SASAYAMA等[10]將24例通過核磁共振成像(MRI)檢測懷疑為PCNSL的患者納入前瞻性研究，分析發(fā)現(xiàn)有6例患者腦脊液IL-10水平較高，其中有5例診斷為PCNSL，而在腦脊液IL-10水平低于檢測限的患者中沒有PCNSL患者，提示腦脊液中IL-10的升高可能有助于診斷PCNSL。另有研究發(fā)現(xiàn)，較高的腦脊液IL-10水平與較短的無進展生存期相關(guān)[11]，而且腦脊液IL-10水平越高，Karnofsky性能評分越低[12]，表明腦脊液IL-10表達水平與PCNSL疾病預(yù)后密切相關(guān)。并且腦脊液IL-10表達水平變化早于MRI[12]，提示可通過檢測腦脊液IL-10的水平變化更早地預(yù)測疾病發(fā)展趨勢[11]。WANG等[13]綜合分析了4項研究，發(fā)現(xiàn)當(dāng)腦脊液IL-10水平臨界值為6.88 pg/mL時，診斷CNSL的靈敏度和特異度分別為81%和97%。因此，腦脊液IL-10蛋白水平不僅可作為診斷CNSL的敏感的生物學(xué)標(biāo)志物，也可用于疾病早期復(fù)發(fā)檢測、預(yù)后評估和治療方案的制訂。

2.2IL-6及IL-10/IL-6比值 IL-6可募集T淋巴細(xì)胞并誘導(dǎo)細(xì)胞分化，參與免疫反應(yīng)和炎癥調(diào)節(jié)。UNGUREANU等[14]比較了28例PCNSL患者和15例中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥性疾病(CNSID)患者腦脊液中IL-6和IL-10的水平，發(fā)現(xiàn)與健康對照組相比，CNSID組和PCNSL組腦脊液IL-6和IL-10水平均顯著升高，PCNSL患者的腦脊液IL-10水平明顯高于CNSID患者，而CNSID患者的腦脊液IL-6水平明顯高于PCNSL，表明腦脊液IL-6和IL-10的聯(lián)合檢測可以更好區(qū)分CNSID和PCNSL兩種疾病。多項研究表明，IL-10/IL-6比值對區(qū)分PCNSL和神經(jīng)炎癥性疾病有一定的診斷價值[15-16]，當(dāng)IL-10/IL-6比值臨界值為2.72時，其診斷PCNSL的靈敏度與特異度為74.2%和97.8%，而且IL-10與IL-10/IL-6比值聯(lián)合診斷的靈敏度和特異度較單項診斷明顯提高[17]。因此，對腦脊液IL-10和IL-6檢測結(jié)果進行聯(lián)合分析可提高CNSL診斷的特異度和靈敏度。

2.3趨化因子配體13(CXCL13) CXCL13可參與調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞發(fā)育，并趨化B細(xì)胞和輔助性T細(xì)胞歸巢至生發(fā)中心[18]。MAEYAMA等[19]發(fā)現(xiàn)，CNSL患者腦脊液中CXCL13及CXCL13受體的表達明顯高于其他中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，而且治療后患者腦脊液CXCL13水平明顯降低，復(fù)發(fā)患者腦脊液CXCL13水平明顯升高，提示腦脊液CXCL13的表達水平與疾病預(yù)后呈負(fù)相關(guān)。此外，MASOURIS等[20]發(fā)現(xiàn)，CNSL患者腦脊液CXCL13的臨界值為80 pg/mL時，其診斷的靈敏度和特異度為90.7%和90.1%。有研究報道，腦脊液中IL-10和CXCL13水平聯(lián)合檢測可提高診斷CNSL的特異度[21]。因此，腦脊液CXCL13不僅可作為診斷CNSL的生物標(biāo)志物，也可作為CNSL的預(yù)后檢測指標(biāo)。

2.4可溶性IL-2受體 白細(xì)胞介素2受體(IL-2R)主要表達在活化的T細(xì)胞上，也會以可溶性IL-2R(sIL-2R)的形式釋放到循環(huán)中，sIL-2R的半衰期較長[22]。研究表明腦脊液sIL-2R的水平變化對診斷淋巴瘤中樞浸潤具有相對較高的靈敏度，是診斷淋巴瘤中樞浸潤的有效生物學(xué)標(biāo)志物[23]。SASAGAWA等[24]發(fā)現(xiàn)，CNSL患者腦脊液sIL-2R表達水平臨界值為60.4 U/mL時，其靈敏度為94.7%，特異度為84.6%。同時，IKEGUCHI等[25]發(fā)現(xiàn)，CNSL患者腦脊液sIL-2R水平顯著高于中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥性脫髓鞘病患者，而且用腦脊液sIL-2R水平診斷CNSL時，其靈敏度與特異度分別為83.3%和90.0%。因此，腦脊液sIL-2R水平可作為CNSL診斷的生物學(xué)標(biāo)志物。

2.5B細(xì)胞激活因子 B細(xì)胞激活因子(BAFF)是腫瘤壞死因子家族的配體，可參與調(diào)節(jié)B細(xì)胞的存活、成熟和分化，淋巴瘤細(xì)胞可以通過自分泌BAFF的方式逃避細(xì)胞凋亡[26]。MULAZZANI等[27]將116例疑似腦局灶病變患者納入前瞻性研究，研究發(fā)現(xiàn)腦脊液BAFF蛋白水平可有效地診斷CNSL，且該指標(biāo)的表達水平與疾病的預(yù)后密切相關(guān)。MIZUTANI等[28]發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合檢測腦脊液BAFF和跨膜激活劑和CAML相互作用因子(TACI)的表達水平對診斷PCNSL具有高特異度和靈敏度。因此，腦脊液中的BAFF可以作為診斷CNSL和監(jiān)測預(yù)后的生物學(xué)新指標(biāo)。

2.6可溶性CD27(sCD27) CD27是淋巴細(xì)胞特異性TNF受體超家族成員，sCD27是游離的CD27蛋白單體，在T淋巴細(xì)胞和大多數(shù)B細(xì)胞惡性腫瘤細(xì)胞中都有不同程度的表達。KERSTEN等[29]通過前瞻性研究發(fā)現(xiàn)，腦脊液sCD27在診斷急性白血病和非霍奇金淋巴瘤中神經(jīng)受累的靈敏度和特異度分別為100%、82%，但在感染性和炎癥性中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的腦脊液中，sCD27表達水平也可能升高[30]，因此，腦脊液sCD27水平對診斷CNSL的特異性還需進一步研究探討。

3 基因突變檢測

CNSL患者中Toll樣受體配體髓樣分化因子88(MYD88)突變和B細(xì)胞抗原受體(BCR)亞基CD79b突變的發(fā)生率較高[31]。MYD88是一種Toll樣受體配體，可激活I(lǐng)L-1和IL-18信號通路[32]，已有研究報道CNSL中MYD88基因發(fā)生高頻率突變，其中以L265P位點基因突變最為常見[32-33]。CD79b突變常發(fā)生于編碼BCR的基因上，最常見的是免疫受體酪氨酸激活基序(ITAM)Y196的錯義突變。FERRERI等[34]對17例PCNSL患者進行了MYD88突變檢測，共15例患者存在MYD88 L265P突變，陽性率為88%。以往研究分析發(fā)現(xiàn)MYD88突變在PCNSL中發(fā)生率為78.9%，而在SCNSL中為55.6%[2]。BRAGGIO等[35]通過陣列比較基因組雜交技術(shù)及全基因組測序技術(shù)分析了PNCSL患者中與免疫反應(yīng)、增殖、凋亡和淋巴細(xì)胞分化相關(guān)的信號通路，發(fā)現(xiàn)90%以上的PNCSL患者中B細(xì)胞受體/Toll樣受體/NF-κB通路發(fā)生改變。RADKE等[2]通過全基因測序比較了51例CNSL和75例淋巴瘤對照組患者的JAK-STAT、NF-κB、B細(xì)胞受體信號通路相關(guān)基因，發(fā)現(xiàn)在CNSL中MYD88 L265P突變占67%、CD79b突變占63%，周期素依賴性蛋白激酶抑制因子2A(CDKN2A)基因缺失占83%，MYD88 L265P突變和CDKN2A基因缺失可作為PCNSL發(fā)病早期的基因檢測位點，而且PCNSL患者中端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶(TERT)基因表達明顯高于淋巴瘤對照組患者，該指標(biāo)可提示PCNSL患者預(yù)后情況。

4 循環(huán)腫瘤DNA(ctDNA)

ctDNA是腫瘤細(xì)胞壞死或凋亡后釋放至胞外的DNA，其半衰期短，可準(zhǔn)確反映腫瘤當(dāng)前情況，有助于對存在高危因素的淋巴瘤患者在疾病早期發(fā)現(xiàn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)浸潤[36]。WATANABE等[37]通過對26例CNSL患者腦脊液ctDNA進行檢測發(fā)現(xiàn)其中20例(76.9%)為MYD88突變。BOBILLO等[36]發(fā)現(xiàn)，相較于血漿ctDNA及FCM，腦脊液ctDNA可更好檢測CNSL的發(fā)生，且對CNSL早期預(yù)測價值大于MRI或FCM。近期有多項研究通過檢測腦脊液ctDNA變化來監(jiān)測CNSL的預(yù)后情況[38-41]，提示腦脊液ctDNA可作為CNSL診斷及復(fù)發(fā)的早期檢測指標(biāo)及疾病預(yù)后監(jiān)測指標(biāo)。

5 微小RNA(miRNA)

miRNA是一種小的、非編碼的、可調(diào)節(jié)的RNA分子，其主要是通過結(jié)合mRNA轉(zhuǎn)錄本的3′-非翻譯區(qū)來調(diào)節(jié)其靶mRNA的表達[42-43]。BARANISKIN等[44]通過對PCNSL患者腦脊液中miRNA-21、miRNA-92a和miRNA-19b的聯(lián)合檢測，發(fā)現(xiàn)miRNA可以區(qū)分PCNSL患者與其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病，其靈敏度和特異度分別為95.7%和96.7%。同時研究發(fā)現(xiàn)聯(lián)合檢測腦脊液中miRNA-15b和miRNA-21的表達，可有效區(qū)分膠質(zhì)瘤患者與PCNSL患者，診斷準(zhǔn)確率達90%，特異度可達100%[45]。通過檢測61例PCNSL患者和14例SCNSL患者腦脊液miRNA表達譜，發(fā)現(xiàn)SCNSL患者腦脊液miRNA-30c表達明顯升高，這一指標(biāo)可以有效區(qū)分SCNSL與PCNSL[46]，其靈敏度為90.9%，特異度為85.5%。由此可見，腦脊液miRNAs可作為診斷及鑒別CNSL的生物標(biāo)志物。

6 其他蛋白標(biāo)志物表達水平

研究發(fā)現(xiàn)，腦脊液中原蛋白(PGRN)、抗凝血酶Ⅲ(AT-Ⅲ)和β2-微球蛋白(β2-MG)等表達升高，對診斷淋巴瘤中樞神經(jīng)浸潤也有一定的提示作用[3,47-48]。PGRN是一種分泌性糖基化蛋白，在腫瘤生長和生存中發(fā)揮著重要作用[48]。AT-Ⅲ蛋白參與血管內(nèi)外的凝血過程，可調(diào)節(jié)腫瘤血管的生成，KUUSISTO等[49]發(fā)現(xiàn)，CNSL患者中腦脊液AT-Ⅲ表達明顯升高，雖然不能獨立作為診斷CNSL的標(biāo)志物，但腦脊液AT-Ⅲ/清蛋白比值可作為診斷CNSL更為靈敏與特異的指標(biāo)。β2-MG是細(xì)胞表面人類淋巴細(xì)胞抗原(HLA)的β鏈部分，主要由淋巴細(xì)胞、血小板、多形核白細(xì)胞產(chǎn)生。MAEYAMA等[19]利用腦脊液CXCL13、IL-10、β2-MG和sIL-2R構(gòu)建了多指標(biāo)診斷模型，其診斷的靈敏度與特異度能達97%和97%。雖然AT-Ⅲ、β2-MG及PGRN這些腦脊液標(biāo)志物對于CNSL的診斷并不特異，在其他神經(jīng)系統(tǒng)炎癥性疾病如腦膜炎中也可能升高，不能有效地區(qū)分CNSL與其他神經(jīng)病變疾病，但這些檢測指標(biāo)聯(lián)合其他生物學(xué)指標(biāo)時，可提高診斷CNSL的靈敏度與特異度。

7 總結(jié)與展望

對淋巴瘤中樞神經(jīng)系統(tǒng)浸潤進行早期診斷、風(fēng)險預(yù)測及早期干預(yù)目前仍是臨床工作的難點。腦脊液流式細(xì)胞免疫分型、細(xì)胞因子檢測、基因檢測、ctDNA、miRNAs等多種新技術(shù)的發(fā)展也為診斷CNSL提供了新思路。隨著流式細(xì)胞檢測技術(shù)在臨床中的應(yīng)用，結(jié)合常規(guī)細(xì)胞學(xué)檢查和病理學(xué)活檢，診斷的靈敏度可提高2～3倍[5]。但由于腦脊液中細(xì)胞存活時間一般較短[7]，細(xì)胞數(shù)量少，流式細(xì)胞免疫分型及細(xì)胞基因檢測對CNSL的診斷仍存在一定的局限性。腦脊液ctDNA和miRNA的檢測可彌補流式細(xì)胞免疫分型與細(xì)胞基因檢測的不足，具有一定的應(yīng)用前景，但臨床應(yīng)用并不廣泛。腦脊液細(xì)胞因子檢測采用的標(biāo)本為腦脊液離心后的上清液，對細(xì)胞數(shù)量無要求，而且可冷凍保存，在診斷及預(yù)測淋巴瘤中樞神經(jīng)系統(tǒng)浸潤中具有重要價值。腦脊液IL-10/IL-6比值可有效區(qū)分CNSID與CNSL，而且腦脊液CXCL13、sIL-2R、BAFF等生物學(xué)標(biāo)志物均可有效診斷CNSL與其他神經(jīng)系統(tǒng)性疾病。雖然腦脊液sCD27、AT-Ⅲ、β2-MG、PGRN等蛋白指標(biāo)不能獨立診斷CNSL，但聯(lián)合檢測多項腦脊液生物學(xué)指標(biāo)檢測可有效提高對CNSL診斷及預(yù)測的靈敏度與特異度。

綜上所述，腦脊液樣本獲取方便，可動態(tài)監(jiān)測疾病的進展，腦脊液流式細(xì)胞免疫分型聯(lián)合細(xì)胞因子檢測，可使標(biāo)本得到更合理的利用。有條件時，多項指標(biāo)的聯(lián)合檢測可提高診斷CNSL的靈敏度及特異度，為CNSL的早期診斷及預(yù)測提供更多參考。