基于免疫顯色法分析137例兒童耐碳青霉烯革蘭陰性菌的碳青霉烯酶表型

李 嬋，陳 楠

天津市兒童醫院檢驗科，天津 300134

革蘭陰性菌是醫院感染的關鍵病原菌，大部分具備多重耐藥性，在全部β-內酰胺抗菌藥物中，碳青霉烯類抗菌藥物的抑菌活力最強。近年來，伴隨著碳青霉烯類抗菌藥物的廣泛及不合理應用，革蘭陰性菌對這種抗菌藥物形成了越來越多的耐藥性，不斷有在兒童或新生兒群體中暴發感染的報道[1-2]。根據全國細菌耐藥監測網(CRASS)數據顯示，2019年兒童醫院的耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌檢出率為14%，高于三級醫院的11.6%和二級醫院的5.5%，同時比2018年兒童醫院的耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌檢出率(13.8%)增加0.2%。同時，耐碳青霉烯鮑曼不動桿菌(CRAB)和耐碳青霉烯銅綠假單胞菌(CRPA)檢出率隨著碳青霉烯類抗菌藥物的廣泛和不合理使用也日益增多。產生碳青霉烯酶是腸桿菌科細菌對碳青霉烯類藥物耐藥最主要的機制[3]。本研究使用免疫顯色法檢測了本地區兒童臨床分離的耐碳青霉烯革蘭陰性菌產生的碳青霉烯酶表型，為臨床合理使用抗菌藥物提供依據，同時采用PCR檢測對免疫顯色法檢測的結果進行驗證，以明確此方法的準確性。

1 材料與方法

1.1材料 收集2019-2020年從本院住院患兒臨床標本中分離得到的對亞胺培南或美羅培南耐藥的腸桿菌科細菌(共75株,其中肺炎克雷伯菌53株、大腸埃希菌22株)和非發酵菌(共62株，其中鮑曼不動桿菌20株、銅綠假單胞菌42株)，去除同一患者的重復菌株。

1.2儀器與試劑 VITEK MS、VITEK 2 Compact、PCR擴增儀購自賽默飛世爾科技有限公司；KPC型與NDM型碳青霉烯酶免疫顯色試劑盒、VIM型碳青霉烯酶免疫顯色試劑盒、OXA-23型碳青霉烯酶免疫顯色試劑盒、OXA-48型碳青霉烯酶免疫顯色試劑盒購自北京金山川公司；亞胺培南和美羅培南藥敏紙片購自賽默飛世爾科技有限公司。

1.3方法

1.3.1細菌的鑒定與藥敏試驗 采用VITEK MS和VITEK 2 Compact全自動微生物質譜檢測系統和全自動微生物鑒定儀對腸桿菌科細菌及非發酵菌各自開展鑒定和藥敏試驗。選用紙片法(K-B法)核查全自動儀器對亞胺培南和/或美羅培南耐藥性的檢測結果，確定待測菌株對亞胺培南和/或美羅培南的耐藥性與全自動儀器法檢測結果一致，折點參照CLSI M100 S29中的規范。

1.3.2PCR檢測耐藥基因 (1)待測菌核酸提?。簩⑻暨x出的菌株接種于血平板，35 ℃恒溫箱孵育18～24 h，挑單獨菌落添加50 μL無菌dd H2O攪拌，100 ℃水浴10 min，裂解細菌釋放出來DNA，以12 000 r/min離心5 min，取上清液檢測吸光度(A)比值A260/A280，評估DNA提取質量。將得到的上清液分裝，于-20 ℃保存。(2)引物設計及擴增5種碳青霉烯酶基因：耐藥基因引物序列參考文獻[4-5]，由金唯智生物科技(北京)有限公司合成。引物序列見表1。

表1 PCR引物序列

續表1 PCR引物序列

1.3.3免疫顯色法檢測碳青霉烯酶表型 使用免疫顯色試劑盒進行檢測，嚴格按說明書進行操作。

1.4統計學處理 采用SPSS22.0軟件進行數據處理。計數資料以例數或百分率表示，組間比較采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。采用WHONET5.6軟件分析細菌耐藥性。

2 結 果

2.1耐碳青霉烯類腸桿菌科細菌(CRE)的碳青霉烯酶表型分析

2.1.1PCR檢測耐藥基因 共檢測出blaKPC型11株，全部為肺炎克雷伯菌；blaNDM型37株，包含23株肺炎克雷伯菌和14株大腸埃希菌；blaKPC+blaNDM混合型19株，均為肺炎克雷伯菌；blaNDM+blaOXA-23混合型3株，均為大腸埃希菌；另有5株大腸埃希菌的耐藥機制不在檢測的5種碳青霉烯酶表型范圍內。

2.1.2免疫顯色法檢測碳青霉烯酶表型 共檢測出blaKPC型12株，全部為肺炎克雷伯菌；blaNDM型40株，分別為23株肺炎克雷伯菌和17株大腸埃希菌；blaKPC+blaNDM混合型18株，均為肺炎克雷伯菌；blaOXA-23型1株，確認為大腸埃希菌；另有4株大腸埃希菌耐藥機制不在檢測的5種碳青霉烯酶表型范圍內。

2.1.3免疫顯色法檢測碳青霉烯酶表型的效能評估 以PCR檢測結果作為金標準，對免疫顯色法檢測碳青霉烯酶從符合率、靈敏度、特異度等方面進行評估，經χ2檢驗，兩種方法檢測碳青霉烯酶主要表型的結果比較差異無統計學意義(P>0.05)，見表2。75株CRE用兩種方法檢測，blaVIM和blaOXA-48兩種表型結果均為陰性。

表2 兩種方法檢測碳青霉烯酶主要表型的比較

2.262例兒童耐碳青霉烯非發酵菌的碳青霉烯酶表型分析

2.2.1PCR檢測耐藥基因 20株CRAB檢測到3種碳青霉烯酶基因，分別為blaNDM型(12株)、blaNDM+blaKPC型(2株)、blaNDM+blaOXA-23型(1株),以blaNDM型為主；42株CRPA檢測到blaKPC型23株。

2.2.2免疫顯色法檢測碳青霉烯酶表型 使用免疫顯色法對碳青霉烯酶表達陽性的菌株進行檢測，CRAB中檢測到blaNDM型12株、blaNDM+blaKPC型1株、blaNDM+blaOXA-23型1株，CRPA中檢測到21株blaKPC型。

2.2.3免疫顯色法檢測碳青霉烯酶表型的效能評估 以PCR結果為金標準，免疫顯色法檢測CRAB和CRPA碳青霉烯酶表型的靈敏度、特異度均較高。經χ2檢驗，兩種方法檢測的碳青霉烯酶表型結果比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 兩種方法檢測碳青霉烯酶主要表型的比較

2.3產碳青霉烯酶革蘭陰性菌的耐藥情況分析 CRE菌株對阿米卡星、慶大霉素和妥布霉素耐藥率較低，而對頭孢類抗菌藥物的耐藥率幾乎都在90%以上；CRAB菌株對阿米卡星、四環素、妥布霉素等耐藥率低；CRPA對阿米卡星耐藥率低，對慶大霉素和妥布霉素耐藥率在50%左右，見表4。

表4 耐碳青霉烯革蘭陰性菌的耐藥情況(%)

2.4產碳青霉烯酶革蘭陰性菌的臨床分布特征 <1歲的幼兒分離到CRE的比例明顯高于≥1歲的兒童，而非發酵菌(CRAB和CRPA)則主要分離自1～10歲的兒童(64.5%)的臨床標本。分離到CRE的患兒中，男性所占比例高于女性；分離到非發酵菌的患兒中，男性所占比例(58.1%)比女性(41.9%)略高；分離到CRE最多的臨床標本類型是尿液(37.3%)，分離到非發酵菌最多的臨床標本則是痰液(48.6%)。見表5。

表5 分離到產碳青霉烯酶革蘭陰性菌的感染患兒臨床特征及標本來源分析

3 討 論

銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌和腸桿菌科細菌多見于自然界、醫療環境中以及皮膚上。它們是目前臨床中檢出最多的革蘭陰性菌，是醫院門診繼發感染的關鍵致病菌，尤其是鮑曼不動桿菌和銅綠假單胞菌，可引起全身多個部位的感染，是泛耐藥菌中最常見的細菌。革蘭陰性菌對碳青霉烯類抗菌藥物耐藥性的報道越來越多，對于兒童該類報道的數量也在逐年增多,但大多數是小范圍報道[6-7]。

本研究結果顯示：CRE中，肺炎克雷伯菌產碳青霉烯酶表型分別為blaNDM(43.40%)、blaKPC+blaNDM(35.85%)、blaKPC(20.75%)，大腸埃希菌產碳青霉烯酶表型則分別為blaNDM(63.64%)、blaNDM+blaOXA-23(13.64%)、其他(22.73%)。肺炎克雷伯菌以blaNDM型(包含與blaKPC混合型)為主，與國內某大型兒童醫院的77.3%blaNDM型肺炎克雷伯菌的報道基本一致[8]。大腸埃希菌也以blaNDM型為主，與blaNDM型大腸埃希菌的主要流行區域是亞洲大陸的中國和印度的報道一致[9-10]。但北京地區兒童患者分離的碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌是以blaKPC和blaIMP-4型金屬酶為主。這種碳青霉烯酶類型不同的現象，可能與各地區使用抗菌藥物種類不同有關[11]。而62株非發酵菌結果中，20株CRAB檢測到3種碳青霉烯酶基因以blaNDM型為主，與王紫琦等[12]研究的以blaOXA-23型檢出為主的結論不同，可能與地區和人群不同相關；42株CRPA以blaKPC為主。blaKPC型CRPA中帶blaKPC-2基因質粒[13]，這種耐藥特性將如同其在腸桿菌科細菌一樣在銅綠假單胞菌中播散。

以PCR檢測結果為金標準，免疫顯色法檢測CRE的3種主要表型blaKPC、blaNDM、blaOXA-43與PCR檢測結果比較差異無統計學意義(P>0.05)。同時，免疫顯色法對62株菌非發酵菌的結果也與PCR檢測結果比較差異無統計學意義(P>0.05)。但有幾株菌出現PCR陽性而免疫顯色法陰性，可能是因為菌株中目標耐藥基因的表達水平低于免疫顯色法試劑的檢測低限，而PCR通過擴增過程可以檢測到。綜上所述，PCR法與免疫顯色法同樣可以檢測腸桿菌及非發酵菌的碳青霉烯酶耐藥基因。

綜上所述，腸桿菌和非發酵菌碳青霉烯酶耐藥基因分型所使用的免疫顯色法具有操作簡便、報告快速、便于操作、不易污染等特點，而且可用于檢測非發酵菌和腸桿菌科細菌，優于其他傳統的檢測方法，適合基層醫療機構實驗室常規開展。但本研究的標本量偏少，需要日后積累更多的菌株后進行大樣本量檢測和分析，以期為臨床個性化用藥、及時準確地進行評估提供更多參考。