重組分泌型Fas配體對肝癌細(xì)胞株HepG2凋亡的影響*

尚小玲，汪宏良，馮琴琴，胡 芳，楊 浩，諶章舟

1.黃石市中心醫(yī)院/湖北理工學(xué)院附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗科，湖北黃石 435000；2.湖北理工學(xué)院醫(yī)學(xué)院，湖北黃石 435003；3.腎臟疾病發(fā)生與干預(yù)湖北省重點實驗室，湖北黃石，435003；4.黃石市婦幼保健院產(chǎn)科，湖北黃石 435003

Fas/Fas配體(FasL)是一個重要的凋亡途徑，對維持機體穩(wěn)態(tài)起著非常重要的作用，可以激活胞內(nèi)Caspase級聯(lián)反應(yīng)，促進細(xì)胞骨架降解和DNA片段化，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的發(fā)生。凋亡受體Fas即CD95，是一個重要的TNF受體家族成員，正常情況下在細(xì)胞表面跨膜表達，其蛋白相對分子質(zhì)量為36×103[1-3]。FasL是一種可以與死亡受體TNFRSF6/Fas結(jié)合的細(xì)胞因子，它可以通過細(xì)胞毒作用誘導(dǎo)T細(xì)胞凋亡[4]。在人體內(nèi)，F(xiàn)as與其配體FasL結(jié)合后促使Fas陽性的細(xì)胞迅速凋亡。Fas與其配體FasL的結(jié)合可使正常細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡，細(xì)胞凋亡是機體抵御癌癥的重要防御手段，這種現(xiàn)象最常見于細(xì)胞毒性T細(xì)胞之中，這種現(xiàn)象是機體排除異常的細(xì)胞、清除異物的主要方式。Fas與其配體FasL都參與維持機體免疫環(huán)境的穩(wěn)定[5-7]。免疫抑制治療是通過阻滯某些特定的通路來抵抗腫瘤。T細(xì)胞是殺滅腫瘤的主力軍，其表面可表達多種免疫抑制受體，而腫瘤細(xì)胞表面可以產(chǎn)生相應(yīng)配體。配體通過與T細(xì)胞表面受體因子的結(jié)合，如Fas/FasL的結(jié)合，抑制T細(xì)胞的活化來抑制免疫應(yīng)答反應(yīng)[8-10]。Fas/FasL凋亡系統(tǒng)是誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的重要途徑。將分泌型FasL轉(zhuǎn)染至人肝癌細(xì)胞后，分泌到細(xì)胞外的FasL可反作用于肝癌細(xì)胞表面凋亡受體Fas，觸發(fā)肝癌細(xì)胞內(nèi)的凋亡信號通路。本研究構(gòu)建了含有IL2信號肽序列的FasL基因重組慢病毒表達載體pCDH-IL2sig-FasL,利用磷酸鈣轉(zhuǎn)染技術(shù)將重組慢病毒載體及另外2個輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至HEK293細(xì)胞中，制備出具有感染性的缺陷型活病毒粒子，直接感染HepG2細(xì)胞,然后檢測外源性FasL基因的分泌性表達對對人肝癌細(xì)胞HepG2凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1材料 人肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞株、人胚腎細(xì)胞HEK293細(xì)胞、大腸桿菌Top10為腎臟疾病發(fā)生與干預(yù)湖北省重點實驗室所有；真核表達載體pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP+Puro(簡稱pCDH)、pcDNA3、psPAX2、pMD2.G購自湖南豐暉生物科技有限公司；Fas及FasL單克隆抗體購自Cell Signaling公司，Caspase-8及Actin單克隆抗體購自武漢三鷹生物公司；PrimeSTAR?HS DNA Polymerase、TRIzol RNA、RNA to cDNA EcoDry premix (oligo dT)、內(nèi)切酶-BamHⅠ、XbaⅠ、NotⅠ、DNA連接酶等分子克隆相關(guān)試劑購自TaKaRa公司；2×Sybr Green 實時熒光定量PCR(qPCR)混合液購自上海翊圣生物公司；胎牛血清購自Biological Industries公司；嘌呤霉素購自武漢益易普公司；胰酶、雙抗、DMEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；人FasL酶連免疫吸附測法(ELISA)試劑盒購自江蘇酶標(biāo)生物科技有限公司公司；MTT試劑盒購自碧云天公司；二抗-HRP山羊抗兔IgG(H+L)抗體和HRP山羊抗鼠IgG(H+L)抗體購自安迪福諾生物科技武漢有限公司；RIPA裂解緩、ECL超敏發(fā)光液購自北京普利萊公司；引物均由武漢奧科公司合成。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 人肝癌細(xì)胞HepG2及人胚腎細(xì)胞HEK293分別用含10%胎牛血清、1%雙抗(P/S)的DMEM培養(yǎng)液置于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，0.25%胰蛋白酶(含0.02%EDTA)消化傳代。

1.2.2重組慢病毒載體pCDH-IL2sig-FasL的構(gòu)建與鑒定 以pcDNA3-IL2sig-FasL質(zhì)粒為模板，設(shè)計引物擴增IL2sig-FasL cDNA片段，引物序列F：CTAGTCTAGAATGTACAGGATGCAACTCCT，R：CGCGGATCCTTAGAGCTTATATAAGCCGA。利用XbaⅠ和BamHⅠ兩種限制性內(nèi)切酶同時酶切pCDH和擴增片段，分別純化和回收雙酶切后的載體pCDH和IL2sig-FasL片段，在DNA連接酶作用下將帶有缺口的pCDH載體和IL2sig-FasL片段連接(16 ℃連接4 h)，轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞Top10中，37 ℃過夜培養(yǎng)。經(jīng)雙酶切、菌液PCR及瓊脂糖凝膠電泳鑒定重組質(zhì)粒pCDH-IL2sig-FasL，最后將重組質(zhì)粒送武漢奧科公司測序。

1.2.3重組慢病毒LV-IL2sig-FasL和陰性對照病毒的制備及對HepG2細(xì)胞的感染 培養(yǎng)HEK293細(xì)胞，長滿后接種到8個直徑為10 cm的培養(yǎng)皿中，待其生長至密度約為60%左右開始轉(zhuǎn)染，其中4個培養(yǎng)皿用于重組慢病毒載體轉(zhuǎn)染，4個培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)染陰性對照慢病毒載體(不含IL2sig-Fas)。按照分子克隆實驗磷酸鈣轉(zhuǎn)染法進行操作，同時將pCDH-IL2sig-Fa/pCDH、psPAX2、pMD2.G質(zhì)粒以15、12、9 μg的量用磷酸鈣混合液轉(zhuǎn)染至HEK293細(xì)胞中，于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)至48 h。然后在倒置熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染后的結(jié)果，若HEK293細(xì)胞表達綠色熒光蛋，證明慢病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成功。構(gòu)建的重組慢病毒記為LV-IL2sig-FasL，陰性對照慢病毒(不含IL2sig-Fas)記為LV。回收細(xì)胞培養(yǎng)基直接感染HepG2細(xì)胞，待72 h后加入終濃度為10 μg/mL的嘌呤霉素處理細(xì)胞，每天加1次，持續(xù)4 d，最終獲得全部被慢病毒感染的HepG2細(xì)胞，陽性命名為HepG2-LV-IL2sig-FasL細(xì)胞，陰性命名為HepG2-LV細(xì)胞。

1.2.4ELISA檢測FasL蛋白的分泌 培養(yǎng)HepG2-LV-IL2sig-FasL和HepG2-LV細(xì)胞至第72 h，收集兩種細(xì)胞的培養(yǎng)基，按照人FasL ELISA試劑盒說明書操作，用酶標(biāo)儀在單波長450 nm處測定吸光度值(A450)，每個樣品設(shè)置3個平行重復(fù)檢測。

1.2.5MTT檢測細(xì)胞生長情況 將HepG2-LV-IL2sig-FasL、HepG2-LV、HepG2[作為空白對照(NC)]細(xì)胞分別以1×105/孔的密度種在96孔板中，每種細(xì)胞設(shè)置3個平行重復(fù)檢測，于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)至48 h后按照MTT試劑盒說明書進行操作，用酶標(biāo)儀在單波長570 nm處測定3種不同細(xì)胞的吸光度值(A570)。

1.2.6qPCR檢測凋亡因子的轉(zhuǎn)錄水平 培養(yǎng)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞HepG2-LV-IL2sig-FasL和HepG2-LV，在第96 h對FasL、Fas、Caspase-8、Fas相關(guān)死亡域蛋白(FADD)等凋亡相關(guān)基因的表達進行qPCR檢測。按TRIzol法提取2組細(xì)胞總RNA,取總RNA約2 μg,反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,反應(yīng)體積為20 μL。以GAPDH作為內(nèi)參,取合成的cDNA 2 μL進行上述凋亡基因的qPCR檢測，每個樣本設(shè)置3個平行檢測，引物序列見表1。所有反應(yīng)體系配制好后，置于ABI QuantStudio 5 qPCR儀進行檢測，PCR反應(yīng)條件為95 ℃ 60 s,60 ℃ 30 s，共40個循環(huán)。當(dāng)qPCR反應(yīng)運行結(jié)束，導(dǎo)出數(shù)據(jù)并在GraphPad Prism 5軟件中進行統(tǒng)計學(xué)分析和作圖。

表1 實時熒光定量PCR引物序列

1.2.7Western blot檢測凋亡因子的蛋白表達水平 分別收集HepG2-LV-IL2sig-FasL、HepG2-LV、HepG2 3種細(xì)胞，用刮鏟刮取細(xì)胞，每個樣品加125 μL RIPA裂解緩沖液冰上裂解10 min，根據(jù)BCA蛋白定量試劑盒說明書操作，用Molecular Devices多功能酶標(biāo)儀測定總蛋白，根據(jù)總蛋白水平確定上樣量。進行SDS-PAGE電泳，條件為120 V、90 min。然后轉(zhuǎn)膜(尼龍膜)，100 V轉(zhuǎn)膜1 h，用濃度為5%的牛奶緩沖液室溫下封閉1 h，分別與FasL、Fas、Caspase-8及β-Actin一抗孵育，4 ℃過夜。PBST洗滌3次，每次10 min，后與相對應(yīng)的二抗室溫孵育1 h，用PBST重復(fù)洗3次，每次10 min。最后用ECL超敏發(fā)光液孵育后置于SGM2018147迷你化學(xué)發(fā)光成像儀顯色。以β-Actin作為內(nèi)參，用ImageJ軟件測灰度值，計算上述蛋白的相對表達水平(以目的蛋白的灰度值與Actin灰度值的比值表示)。每個樣本設(shè)置3個平行重復(fù)檢測。

2 結(jié) 果

2.1重組慢病毒載體pCDH-IL2sig-FasL的構(gòu)建與鑒定 挑取單克隆培養(yǎng)菌株(非藍白斑篩選)，進行菌液PCR擴增，篩選pCDH-IL2sig-FasL陽性質(zhì)粒,產(chǎn)物經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳鑒定，可以發(fā)現(xiàn)有約1 kb的DNA片段，同時抽提陽性重組質(zhì)粒進行雙酶切鑒定，酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳顯示，出現(xiàn)約大于8 kb和約1 kb兩條帶，與預(yù)期結(jié)果相符。最后，將陽性質(zhì)粒送武漢奧科公司測序，將NCBI數(shù)據(jù)庫的序列與測序結(jié)果進行對比，證明序列完全一致。

2.2重組慢病毒的制備 48 h后在倒置熒光顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)HEK293細(xì)胞表達綠色熒光蛋白，說明慢病毒質(zhì)粒制備成功。

2.3ELISA檢測FasL蛋白的細(xì)胞外分泌情況 HepG2-LV細(xì)胞培養(yǎng)基A450為1.0±0.10，HepG2-LV-IL2sig-FasL細(xì)胞培養(yǎng)基A450為1.4±0.05，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.003)，說明加入IL2信號肽的FasL蛋白能夠分泌到細(xì)胞外。

2.4MTT檢測細(xì)胞生長情況 HepG2細(xì)胞A570最高,為4.21±0.15；HepG2-LV細(xì)胞A570為3.5±0.27；HepG2-LV-IL2sig-FasL細(xì)胞A570最低，為2.5±0.07；3種細(xì)胞間兩兩比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與其他兩種細(xì)胞比較，HepG2-LV-IL2sig-FasL細(xì)胞生長受到了明顯抑制，細(xì)胞外分泌的FasL蛋白對HepG2細(xì)胞具有抑制作用。

2.5qPCR檢測凋亡因子的轉(zhuǎn)錄水平 HepG2-LV-IL2sig-FasL細(xì)胞中FasL、Fas、Caspase-8、FADD的相對表達水平分別為HepG2-LV細(xì)胞的5.63±2.88、3.42±0.42、1.77±0.63、3.62±0.45倍，其中FasL、Fas、FADD的表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.6凋亡因子蛋白表達水平的Western blot檢測 HepG2-LV-IL2sig-FasL細(xì)胞的檢測中，F(xiàn)asL有條帶檢出，其余2種細(xì)胞未檢測出明顯條帶；而Fas和Caspase-8在所有細(xì)胞中均有條帶檢出。FasL蛋白在HepG2-LV-IL2sig-FasL細(xì)胞中的相對表達水平為3.4±0.37，明顯高于該蛋白在其他兩種細(xì)胞中的相對表達水平(P<0.001)；Fas和Caspase-8蛋白在HepG2-LV-IL2sig-FasL細(xì)胞中的相對表達水平分別為2.8±0.32和3.0±0.34，也明顯高于這兩種蛋白在其他細(xì)胞中的表表達水平(P<0.001)。見圖1。

注：NC表示作為空白對照的HepG2細(xì)胞；LV表示HepG2-LV細(xì)胞；LV-FasL表示HepG2-LV-IL2sig-FasL細(xì)胞；A為Western blot條帶圖；B、C、D分別為FasL、Fas、Casp-8蛋白在3種細(xì)胞中的相對表達水平比較。

3 討 論

本研究采用慢病毒作為FasL基因的運載工具，將其有效地整合到宿主染色體上，達到FasL在HepG2細(xì)胞中持久性表達的目的。同時克服了一般運載分子的缺點，如使生物大分子構(gòu)象改變、活性部位易受到影響、藥效降低和毒副作用等[11-14]。

Fas/FasL通路在胞內(nèi)具有雙重調(diào)控作用。一方面，F(xiàn)asL與靶細(xì)胞表面受體Fas結(jié)合，使Fas細(xì)胞質(zhì)區(qū)的死亡結(jié)構(gòu)域(DD)與轉(zhuǎn)接器蛋白的FADD結(jié)合，形成死亡誘導(dǎo)信號復(fù)合體(DISC)，進而激活下游的凋亡蛋白，從而介導(dǎo)細(xì)胞凋亡以保證功能異常細(xì)胞能夠被及時清除，在免疫監(jiān)測中扮演著十分重要的作用[15-18]。另一方面，當(dāng)Fas/FasL介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡發(fā)生了異常改變，引起一系列的不良反應(yīng)，繼而對人體造成不良的影響。研究證明Fas或FasL的不正常表達可能與細(xì)胞損傷、生殖系統(tǒng)疾病、免疫疾病、神經(jīng)系統(tǒng)病變、炎癥反應(yīng)、腫瘤發(fā)生有關(guān)[19]。

高彥軍等[20]發(fā)現(xiàn)，PM2.5動物實驗組中大鼠肺組織出現(xiàn)顯著病變并伴有凋亡跡象，隨著刺激物PM2.5水平增加，凋亡水平也增加，而且Western blot證明Fas、FasL、Caspase-8等蛋白的表達隨PM2.5的增加而增加。因此PM2.5的有效暴露可以誘導(dǎo)實驗動物肺上皮細(xì)胞發(fā)生Fas/FasL途徑介導(dǎo)的凋亡。

戴芳等[21]通過對20例臨床精液標(biāo)本進行分析，發(fā)現(xiàn)弱精組、少精組和少弱精組中Fas表達水平與正常組相比均偏高，但與精子濃度、前向運動精子數(shù)呈負(fù)相關(guān)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。同時，少精組和少弱精組中FasL轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)，F(xiàn)as轉(zhuǎn)錄水平與前向運動精子和精子活力呈正相關(guān)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。該研究初步證實Fas/FasL在轉(zhuǎn)錄及表達水平的異常促進了精細(xì)胞凋亡。有研究發(fā)現(xiàn)納米二氧化硅通過誘導(dǎo)小鼠睪丸TM4細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)，激活Fas/FasL通路，促使TM4細(xì)胞發(fā)生凋亡，且納米二氧化硅表現(xiàn)出劑量依賴性地抑制TM4細(xì)胞的存活率和數(shù)量[22]。

毒性彌漫性甲狀腺腫(Graves)患者I131治療前后的對比分析得出，觀察組中外周血Fas表達水平高于對照組，緩解組、復(fù)發(fā)組的Fas表達水平均高于對照組，緩解組Fas表達水平低于觀察組和復(fù)發(fā)組，所有對比均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。由此可見，F(xiàn)as在外周血中的表達水平隨著Graves病程的發(fā)展而升高[23]。還有類似研究顯示慢性淋巴細(xì)胞性甲狀腺炎患者經(jīng)硒酵母聯(lián)合地塞米松治療后，血清中Fas和FasL的蛋白表達水平明顯降低，患者的甲狀腺功能明顯改善[24]。

Fas/FasL通路在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中也扮演重要角色，研究人員發(fā)現(xiàn)在對難治性癲癇患者予以左乙拉西坦聯(lián)合鼠神經(jīng)生長因子治療半年后，可有效控制癲癇發(fā)作，提高臨床療效，且FasL、Fas、Bcl-2等蛋白水平也顯著低于對照組(P<0.05)，說明Fas/FasL通路參與了癲癇的發(fā)病過程[25]。

Fas/FasL通路是維持機體組織正常生理功能的重要信號通路。研究證明，F(xiàn)as和FasL廣泛表達于人體組織細(xì)胞中，一但機體組織細(xì)胞功能遭到破壞，就會直接導(dǎo)致Fas/FasL凋亡通路無法執(zhí)行凋亡程序，啟動異常細(xì)胞的死亡，造成機體相關(guān)組織細(xì)胞走向不可逆轉(zhuǎn)的癌變[26]。結(jié)腸癌細(xì)胞中CD47高表達，但過表達CD47蛋白卻又阻斷Fas/FasL通路，抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞SW480凋亡[27]。辣椒素可以抑制人胃癌細(xì)胞MKN-45的活力，促進Fas/FasL通路介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[28]。研究人員還發(fā)現(xiàn)肝癌和上皮性卵巢癌組織中存在Fas跨膜表達的下調(diào)和FasL跨膜表達增加的情況，這樣腫瘤細(xì)胞表面Fas受體無法被免疫細(xì)胞識別，同時腫瘤細(xì)胞表面異常表達的FasL配體又會結(jié)合免疫細(xì)胞膜表面受體Fas從而誘導(dǎo)免疫細(xì)胞自身凋亡，以此來逃避宿主的免疫應(yīng)答[29-30]。

目前，治療肝癌的主要方法以手術(shù)、放射介入、化療為主，但整體療效有限，多數(shù)患者就診時已屬肝癌晚期，不符合手術(shù)治療范圍，化學(xué)藥物可以阻止癌細(xì)胞的增殖，但藥物不僅作用于癌細(xì)胞，也會對正常的組織細(xì)胞造成損傷，引起臨床不良反應(yīng)。放射治療的不良反應(yīng)也一樣明顯。因此需要尋求有效治療肝癌的新手段，而生物療法是腫瘤治療領(lǐng)域的一場革新，其中就包括免疫檢查點抑制治療法，而Fas/FasL通路在多種疾病特別是腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用，有可能成為治療的靶點。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，添加的IL2信號肽的分子能夠引導(dǎo)FasL蛋白分泌到HepG2細(xì)胞外，還能抑制腫瘤HepG2細(xì)胞增殖，提高細(xì)胞內(nèi)凋亡信號因子的轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達水平，具有明顯的抗腫瘤作用。但本實驗僅在細(xì)胞外證明外源性FasL對HepG2細(xì)胞的抑制效果，本課題組還將進一步開展動物模型體內(nèi)實驗，驗證本研究采用的方法在臨床治療中的可行性。本研究成功采用慢病毒系統(tǒng)表達可分泌至細(xì)胞外的FasL蛋白，初步證明了靶向Fas/FasL通路治療肝癌的可能性，為肝癌治療的研究提供了新的思路。