計算機模擬法探討沒藥治療骨肉瘤的作用機制

楊燕妮，勾偉穎，段辛威，李西海，陳友琴，馬德尊，葉錦霞，付長龍，鄭春松*

（1.福建中醫(yī)藥大學藥學院，福建 福州 350122；2.福建中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結合研究院，福建 福州 350122；3.福建中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結合學院，福建 福州 350122；4.美國凱斯西儲大學醫(yī)學院，美國 俄亥俄州 44106；5.福建省中西醫(yī)結合老年性疾病重點實驗室，福建 福州 350122）

骨肉瘤（osteosarcoma，OS）是一種高發(fā)于青少年的常見原發(fā)性惡性骨腫瘤，具有發(fā)病率高、惡性度大、轉移較早的特點［1］。目前西醫(yī)治療多采用手術治療，輔以化療等，但即使采用較強殺傷力的術前化療方案，仍有20%～30%的患者療效欠佳，表現為復發(fā)、轉移和最終死亡。而且，在治療過程中發(fā)現化療藥物對血液系統(tǒng)、胃腸道、肝臟、心臟、神經系統(tǒng)及泌尿系統(tǒng)等方面具有毒副作用［2］。因此，尋找安全、高效的藥物來治療OS 是急需解決的問題。

近年來，中醫(yī)藥在治療OS 上發(fā)揮越來越重要的作用，有學者查閱了1979 年1 月—2014 年12 月中醫(yī)診療OS 的文獻，總結其用藥規(guī)律，發(fā)現沒藥是OS 臨床中使用頻次高的活血化瘀中藥［3］?，F代藥理研究表明，沒藥中天竺葵素（pelargonidin）、鞣花酸（ellagic acid）和槲皮素（quercetin）等化合物具有抑制OS 細胞增殖的作用，提示沒藥及其活性成分在治療OS 方面有一定的開發(fā)價值［4-6］。但是，沒藥治療OS 的具體作用機制未見相關報道。因此，本研究基于化學空間、相似度分析、網絡藥理學及分子對接的計算機模擬策略［7-8］，探討沒藥治療OS 多成分、多靶點、多途徑的整體調節(jié)作用機制，并將篩選出來的核心靶基因與對應的沒藥活性成分進行對接，以初步驗證沒藥治療OS 的主要成分和靶點，進而為其治療OS 的后續(xù)實驗提供方向，有助于沒藥的進一步開發(fā)和應用。

1 方 法

1.1 沒藥潛在及已報道活性成分數據集建立 利用中藥系統(tǒng)藥理學數據庫及分析平臺（TCMSP，https：//tcmsp-e.com/）檢索沒藥的化學成分［9］，以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、類藥性（drug likeness，DL）≥0.18 為閾值［7］，篩選出其潛在活性成分。從中國知網數據庫中檢索具有抗OS作用的化合物，在Discovery Studio 2.0（簡稱DS 2.0）模擬平臺［10］，轉化成三維分子結構，用MMFF 力場優(yōu)化，分別建立沒藥潛在活性成分及已報道活性化合物的數據集sd 文件。

1.2 沒藥潛在及已報道活性成分數據集化學空間構建與分析 在DS QSAR 模塊下，選擇分子量、氫鍵受體數目、氫鍵給體數目、脂水分配系數和可旋轉鍵數目等84 個分子描述符參數，分別構建沒藥和已報道活性成分數據集化合物的多維化學空間［11-12］；利用主成分分析技術［13］，降維到三維化學空間上。若兩數據集中的化合物在化學空間上距離越近，代表具有相似作用的可能性越大［14］，由此揭示沒藥治療OS 的可能性。

1.3 沒藥潛在及已報道活性成分數據集的相似分子搜索 在DS Library Analysis 模塊下，選擇“Find Similar Molecular by Fingerprints”，以已報道活性成分數據集為Reference Ligands，以沒藥潛在活性成分數據集為Input Ligands，其余參數為缺省值。運行此Protocol，獲得沒藥中與已報道活性成分結構特征相似的分子，以進一步確定沒藥治療OS 的作用。

1.4 沒藥活性成分相關靶點與OS 疾病靶點收集 通過TCMSP 數據庫獲取沒藥活性成分對應的潛在靶點，利用DAVID 數據庫的基因名稱轉換工具，將蛋白靶點轉換為基因名，得到沒藥活性成分相關靶點基因。在GEO DataSets（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）數據庫中篩選出同時含有OS 與正常骨組織樣本的基因芯片為GSE36004、GSE36001、GSE33383、GSE33382 和GSE14359，利用Log2 算法對基因表達數據進行整理，篩選出每個芯片中差異表達基因，同時在OMIM（https：//www.omim.org/）、PharmGkb（https：//www.pharmgkb.org/）、DrugBank（https：//go.drugbank.com/）和GeneCards（https：//www.genecards.org/）數據庫中獲取OS 疾病相關靶點，將上述數據庫中的差異基因取并集，刪除重復基因［15］，作為OS 疾病基因集。

1.5 沒藥活性成分-OS 靶點作用網絡構建 將沒藥活性成分的潛在靶基因與OS 疾病基因取交集，獲得共同靶點，將共同靶點及其對應的沒藥活性成分導入Cytoscape 3.8.1 軟件［16］，構建沒藥活性成分-OS 靶點作用的網絡。

1.6 蛋白質-蛋白質相互作用網絡構建及核心靶點篩選 將“1.5”項下得到的交集基因導入STRING 11.5 數據庫（https：//cn.string-db.org/cgi/input）中，物種設置為“Homo sapiens”，選打分值高于0.9 的蛋白并除去網絡中與其他靶點斷開連接的節(jié)點，建立蛋白質-蛋白質相互作用（protein-protein interaction，PPI）網絡，在Cytoscape 3.8.1 軟件中對PPI 網絡進行拓撲學分析［17］，獲得各節(jié)點介數中心性（betweenness centrality，BC）、接近中心性（closenness centrality，CC）、度中心（degree centrality，DC）、特征向量中心（eigenvector centrality，EC）、局部邊聯(lián)通性（local average centrality，LAC）和網絡中心性（network centrality，NC）數值，以各拓撲學參數值均大于對應中位數值作為篩選條件［18］，得到核心靶基因。

1.7 GO 和KEGG 富集分析 利用基于R 語言、面向基因組信息分析的Bioconductor 軟件合集［19］，對交集基因進行基因本體論（gene ontology，GO）和京都基因和基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes genomes，KEGG）富集分析，設定閾值P＜0.05，探索沒藥中各化合物作用潛在靶點的生物學功能及可能參與的代謝通路。

1.8 核心靶點的分子對接驗證 選擇“1.6”項下核心靶基因及其對應的活性成分進行分子對接［20］，即在PubChem 數據庫中查找沒藥活性成分的2D 化學結構，用ChemOffice 軟件轉化為3D 結構并進行能量最小化優(yōu)化，保存為MOL2 格式。使用PBD 網站（https：//www.rcsb.org/）下載靶蛋白的3D 結構，保存為pbd 格式，導入PyMol 2.4.1 軟件中，刪除水分子以及原配體，然后導入AutoDockTools 1.5.6 軟件，對靶蛋白與藥物小分子進行處理并轉換為pdbqt 格式，并設置活性口袋（Grid Box）大小，運用Vina 進行分子對接，獲取沒藥活性成分與靶蛋白的對接結果，用PyMol 軟件打開查看對接圖片結果，繪制結合模式圖。

2 結 果

2.1 沒藥潛在活性成分篩選 根據篩選條件OB≥30%和DL≥0.18，從TCMSP 平臺中篩選出沒藥有45 個潛在活性成分，其中有槲皮素、豆甾醇、鞣花酸等，見表1。

表 1 沒藥活性成分及其參數值

2.2 沒藥潛在及已報道活性成分數據集的化學空間和相似度分析 沒藥潛在活性成分數據集在化學空間上具有較好的分散性，與已報道活性成分數據集有相同或相近的化學空間，見圖1。兩者在分子量、氫鍵受體、氫鍵給體、脂水分配系數、環(huán)數目和可旋轉鍵數方面，具有很大部分的重疊，見表2。

2.3 沒藥潛在及已報道活性成分數據集的相似分子搜索 以已報道活性成分數據集為參照配體，以Tanimoto相似系數為評價指標，從沒藥潛在活性成分數據集篩選出相似的分子MOL000098、MOL001001、MOL001126、MOL000358和MOL000449，相似度值分別為1、0.733、0.544、0.472 和0.466。

2.4 沒藥活性成分-靶點作用網絡構建 在TCMSP數據庫中收集到沒藥潛在活性成分對應的靶點基因共393 個；在OMIM、PharmGkb、DrugBank、GEO 和GeneCards 數據庫中共得到5 114 個OS 疾病差異表達基因。取交集，得到共同靶點129個，在TCMSP中對應的沒藥潛在活性成分32 個，在Cyotoscape 3.8.1軟件中構建沒藥活性成分-靶點作用網絡，結果顯示，網絡中有161 個節(jié)點，283 條邊；且有3 個化合物只作用1 個靶點，有8 個作用2 個靶點，有21 個作用3 個及以上靶點，見圖2。

圖1 沒藥潛在及已報道活性成分數據集的化學空間圖

表2 沒藥潛在及已報道活性成分數據集的描述符值

圖2 沒藥活性成分-交集靶點網絡圖

2.5 沒藥治療OS 的PPI 網絡構建及其核心靶點篩選 把129 個交集基因導入STRING 數據庫中，得到沒藥治療OS 的PPI 網絡，結果顯示，網絡中有116 個節(jié)點，449 條邊，見圖3。在Cyotoscape 3.8.1軟件中對119 個基因進行2 次網絡拓撲學篩選，得到沒藥治療OS 的8 個潛在核心基因，分別為Akt 絲氨酸/蘇氨酸激酶（Akt serine/threonine kinase 1，Akt1）、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase 1，MAPK1）、FOS 原癌基因（fos proto-oncogene，FOS）、熱 休 克蛋 白90 α 家 族A 類 成員1（heat shock protein 90 alpha family class A member 1，HSP90AA1）、JUN 原 癌 基 因（Jun proto-oncogene，JUN）、雌激素受體相關受體1（estrogen receptor 1，ESR1）、RELA 原癌基因（RELA proto-oncogene，RELA）和MYC 原癌基因（MYC proto-oncogene，MYC），結果見圖4。

圖3 沒藥治療骨肉瘤的蛋白質-蛋白質相互作用網絡圖

2.6 GO 和KEGG 富集分析

2.6.1 GO 功能富集分析 對129 個交集基因進行GO 富集分析，共有2 174 條結果，其中BP 共有1 987 條結果，主要集中在對藥物的應答（response to drug）、輻射的應答（response to radiation）、化學應激（cellular response to chemical stress）、脂多糖的應答（response to lipopolysaccharide）、細菌來源分子的應答（response to molecule of bacterial origin）、金屬離子的應答（response to metalion）、氧水平的應答（response to oxygen levels）、類固醇激素的應答（response to steroid hormone）、活性氧代謝過程（reactive oxygen species metabolic process）等；CC 共 有40 條結果，主要集中在膜筏（membrane raft）、膜微區(qū)（membrane microdomain）、細胞器外膜（organelle outer membrane）、外膜（outer membrane）、線粒體外膜（mitochondrial outer membrane）、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶復合物（serine/threonine protein kinase complex）、蛋白激酶復合物（protein kinase complex）、髓鞘（myelin sheath）等；MF 富集共有147 條結果，主要有DNA-轉錄因子結合（DNA-binding transcription factor binding）、RNA 聚合酶Ⅱ-特異性DNA-轉錄因子結合（RNA polymerase Ⅱ-specific dna-binding transcription factor binding）、泛素樣蛋白連接酶結合（ubiquitin-like protein ligase binding）、泛素蛋白連接酶結合（ubiquitin protein ligase binding）、核受體活性配體激活（ligand-actived nuclear receptor activity）、轉錄因子活性（transcription factor activity）、絲氨酸水解酶活性（serine hydrolase activity）、類固醇激素受體活性（steroid hormone receptor activity）、轉錄共調節(jié)結合（transcription coregulator binding）、轉錄共激活劑結合（transcription coactivator binding）等。取各類富集分析前10 個結果作氣泡圖，見圖5。

圖4 沒藥治療骨肉瘤的核心靶基因網絡圖

圖5 沒藥GO 功能富集分析圖

2.6.2 KEGG 富集分析 KEGG 富集分析有172 條信號通路，主要有脂質和動脈粥樣硬化（lipid and atherosclerosis）、卡波西肉瘤相關化學致癌-受體活化（Kaposi sarcoma-associated chemical carcinogenesis-receptor activation）、皰疹病毒感染（herpesvirus infection）、人類巨細胞病毒感染（human cytomegalovirus infection）、乙型肝炎（hepatitis B）、前列腺癌（prostate cancer）、流體剪切應力和動脈粥樣硬化（fluid shear stress and atherosclerosis）、丙 型 肝 炎（hepatitis C）、愛潑斯坦-巴爾病毒感染（Epstein-Barr virus infection）、糖尿病并發(fā)癥中AGE-RAGE信號通路作用（AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications）、人T 細 胞 白 血 病 病 毒1 感 染（human T-cell leukemia virus 1 infection）、腫瘤壞死因子信號通路（TNF signaling pathway）、癌癥中蛋白聚糖（proteoglycans in cancer）、IL-17 信號通路（IL-17 signaling pathway）、內分泌抵抗（endocrine resistance）、細胞衰老（cellular senescence）、雌激素信號通路（estrogen signaling pathway）細胞凋亡（apoptosis）、C-型凝集素受體信號通路（C-type lectin receptor signaling pathway）、p53 信 號（p53 signaling pathway）通路、慢性骨髓性白血病（chronic myeloid leukemia）以及肝細胞癌（hepatocellular carcinoma）、小細胞肺癌（small cell lung cancer）、乳腺癌（breast cancer）等癌癥相關通路等，前30 條富集結果見圖6。

圖6 沒藥KEGG 富集分析結果圖

2.7 分子對接 對8 個沒藥治療OS 的核心靶點及其對應的活性成分進行分子對接，結果顯示沒藥的化學成分與上述8 個核心靶點的結合能均＜-4 kcal/mol，表現出良好的結合能力，見表3。

3 討 論

中醫(yī)學認為，血瘀日久致毒，瘀毒相互膠著，合而為害，蘊而生變，終成肉瘤，提示瘀血內阻為OS 的重要病機之一，治療上可從活血化瘀論治［3］。而且，現代藥理學研究也表明活血化瘀法可通過調節(jié)機體的HIF-1α、CD4+T 細胞發(fā)揮對荷骨肉瘤裸鼠的治療作用［21］。因此，本文選擇臨床上治療OS常用的活血化瘀藥沒藥為研究對象，進一步探究其治療OS 的機制。

本文先通過化學空間和相似度搜索技術，預測沒藥治療OS 的可能性，根據化學空間理論，相似化學空間的化合物往往具有相似的藥理活性［22］，提示沒藥與已報道活性成分數據集有相同或相近的化學空間，即沒藥具有潛在抗OS 的作用。另外，相似度搜索發(fā)現沒藥中quercetin（MOL000098）、quercetin-3-O-β-D-glucuronide（MOL001001）等與已報道活性成分數據集具有相似的結構特征，根據“結構類似的化合物具有類似的生物活性”［23］，揭示沒藥中存在抗OS 的活性化合物，為進一步研究沒藥治療OS 的網絡藥理學機制提供新依據。

表3 沒藥活性成分與核心靶點分子對接結果

從沒藥治療OS的活性成分-靶點網絡得到32個活性成分，包括槲皮素（quercetin）、鞣花酸（ellagic acid）、β-谷甾醇（β-sitosterol）、天竺葵素（pelargonidin）等。文獻報道，槲皮素能夠影響骨肉瘤細胞增殖、凋亡、侵襲和化療耐藥的能力，起到抗OS 的作用［6］；鞣花酸能抑制骨肉瘤細胞的生長、遷移和侵襲，并通過抑制c-Jun 的轉錄誘導G1 細胞周期阻滯［5］；天竺葵素能通過誘導自噬、線粒體膜電位喪失、G2/M 細胞周期和下調PI3K/Akt 信號通路誘導人骨肉瘤細胞的抗腫瘤作用［4］。因此，沒藥可通過槲皮素、鞣花酸、天竺葵素等多成分治療OS。

從沒藥治療OS 的PPI 網絡拓撲分析得到核心基因Akt1、MAPK1、FOS、HSP90AA1、JUN、ESR1、RELA、MYC。研究發(fā)現，上調Akt1的表達可促進OS的肺轉移，下調AKT1 的表達可明顯抑制MAT1 介導的骨肉瘤細胞遷移和侵襲的促進作用，抑制裸鼠移植瘤生長，減少轉移性肺腫瘤的數量［24］；HSP90AA1作為一種重要的自噬調節(jié)劑，抑制HSP90AA1 可減弱骨肉瘤細胞對化療的自噬保護作用［25］；MYC 高表達與OS轉移及不良預后顯著相關，降低MYC蛋白的表達，導致骨肉瘤細胞增殖、遷移等能力下降［26］。因此，沒藥可通過多個靶點影響骨肉瘤細胞的增殖、遷移和侵襲等。

通過KEGG 富集分析發(fā)現，沒藥活性成分治療OS 的基因主要集中在TNF、IL-17、p53 和凋亡等信號通路。研究表明，TNF 通路參與調節(jié)細胞炎癥反應、細胞生存、凋亡等重要生物過程，TNF 可以和其受體TNFR 結合，作用于下游信號NF-κB，TNF/NF-κB 信號通路被激活后，可以增加CRL4BDACF11的活性，提高P21Cip蛋白的表達水平，從而阻滯骨肉瘤細胞生長周期，發(fā)揮抑制OS 的作用［27-28］；IL-17 信號通路與OS 呈負相關，與轉移呈正相關［29］；激活p53 信號通路可抑制骨肉瘤細胞增殖，促進骨肉瘤細胞凋亡［30-31］。因此，沒藥可通過多通路影響骨肉瘤細胞的增殖、凋亡等方面，發(fā)揮抗OS 的作用。

綜上所述，本研究通過計算機模擬方法，初步預測沒藥治療OS 的作用及其機制，從結果可知，沒藥可通過槲皮素、鞣花酸和天竺葵素等成分，作用于Akt1、JUN 和MYC 等靶點，在TNF 信號通路、IL-17 信號通路、p53 信號通路等參與下，抑制骨肉瘤細胞的增殖、遷移和侵襲等，發(fā)揮治療OS 的作用，為后期實驗進一步研究提供方向。