基于網絡藥理學和分子對接探討石斛合劑治療糖尿病的作用機制

陳 濤，朱銘星，林詩鈴，陳劍鈺，張捷平，施 紅，黃鳴清，鄭燕芳*

（1.福建中醫藥大學藥學院，福建 福州 350122；2.福建中醫藥大學中醫學院，福建 福州 350122；3.福建中醫藥大學中西醫結合學院，福建 福州 350122）

糖尿病患者以慢性高血糖為特征，繼發引起機體組織、細胞損傷［1］。石斛合劑是福建中醫藥大學施紅教授通過長期臨床實踐總結制定，并已成為福建中醫藥大學附屬第二人民醫院院內制劑，由石斛、知母、黃芪、丹參、葛根、黃連、五味子、地龍、蒲公英、大黃等藥物組成，具有清熱、活血、祛毒之功效。前期臨床和基礎研究表明，石斛合劑治療糖尿病及其并發癥具有顯著療效，其作用可能與促進胰島細胞增殖、保護神經系統等有關［2-3］。但由于石斛合劑成分復雜，很難從整體水平系統闡明其治療糖尿病及其并發癥的作用機制。網絡藥理學可通過“多成分-多靶點-多通路”模型顯示藥物和機體之間的聯系，以整體性與系統性為特性，符合中醫的整體觀念［4］。故本研究利用網絡藥理學方法，挖掘石斛合劑在治療糖尿病及其并發癥中潛在的有效成分和作用機制。

1 方 法

1.1 石斛合劑化學成分收集及潛在靶點預測 基于中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP，https：//www.tcmsp-e.com/），以口服利用度（OB）≥30%、類藥性（DL）≥0.18 作為有效成分ADME 篩選條件。同時通過BATMAN-TCM數據庫（http：//bionet.ncpsb.org/batman-tcm/）、ETCM 數據庫（http：//www.tcmip.cn/ETCM/）檢索石斛合劑組成中藥，篩選石斛合劑藥物成分。同時通過中國知網數據庫（CNKI）、PubMed 等網站對已有文獻進行檢索，篩選出同為石斛合劑的潛在活性成分作為補充。將石斛合劑活性成分整理去重后，通過PubChem 平臺（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）獲取石斛合劑潛在活性成分的2D 結構式，置入PharmMapper 平臺（http：//www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/）中，進行潛在靶點預測。選取各化合物潛在靶點評分中的前50 個靶點，并以UniProt 數據庫（https：//www.uniprot.org/）標準化靶點名稱。

1.2 糖尿病潛在作用靶點篩選及藥物-疾病共同作用靶點獲取 以“Diabetes Mellitus”作為關鍵詞，在GeneCards 數據庫（https：//www.genecards.org/）檢索糖尿病相關靶點，將靶點的相關系數＞9.0為卡值，同時通過TTD 數據庫（http：//db.idrblab.net/ttd/）、OMIM 數據庫（https：//www.omim.org/）、DrugBank 數據庫（https：//go.drugbank.com/）進行疾病靶點補充，合并去重，置入UniProt 數據庫標準化靶點名稱，獲得糖尿病相關靶點基因。將石斛合劑中藥物作用靶點與糖尿病相關靶點基因進行映射，得到藥物-疾病共同作用靶點。

1.3 蛋白質相互作用（PPI）網絡構建 將糖尿病相關靶點基因映射到石斛合劑有效成分潛在靶點上，取兩者交集繪制韋恩圖，并導入STRING 平臺（https：//cn.string-db.org/）構建PPI 蛋白互作網絡，利用Cytoscape 3.7.2 軟件進行PPI 網絡圖的繪制。

1.4 GO 富集分析與KEGG 通路分析 利用DAVID平臺對石斛合劑-糖尿病的交集靶點進行GO 富集分析與KEGG 通路分析，將富集分析結果利用微生信網站（http：//www.bioinformatics.com.cn/）作圖后進行可視化分析。

1.5 成分-靶點-通路網絡圖構建 將KEGG 富集分析得到的通路信息通過Cytoscape 3.7.2 軟件構建成分-靶點-通路的網絡圖，對網絡圖進行拓撲分析，分析石斛合劑作用于糖尿病的主要活性成分。

1.6 活性成分與靶點分子對接驗證 從PubChem數據庫下載主要活性成分的3D 結構文件，利用OpenBabel-2.4.1 軟件將其轉化為MOL2 格式文件。選定PPI 網絡核心關鍵靶點，從PDB 數據庫下載核心靶點蛋白的PDB 格式文件，再利用PyMol 軟件對其進行去除配體和水分子等操作。最后將得到的成分文件和靶點文件利用AutoDockTools 1.5.6 和AutoDock Vina 軟件進行分子對接，結合能越低，表示結合活性越強，通常認為結合能＜0 kcal/mol 提示分子之間具有結合活性，＜-5.0 kcal/mol 提示分子之間具有較強的結合活性［5］。利用PyMol 軟件進行可視化分析。

2 結 果

2.1 石斛合劑的活性化合物篩選及靶點預測 通過TCMSP、ETCM、BATMAN-TCM 數據庫進行檢索，同時檢索文獻對化學成分進行補充，最后共得到總有效成分199 個，通過PharmMapper 平臺進行靶點預測，通過UniProt 數據庫統一規范靶點名，刪除重復值，得到活性成分潛在靶點共291 個。石斛合劑藥物對應的潛在活性成分及靶點數目，見表1。

表1 石斛合劑“中藥-活性成分-潛在靶點”信息

2.2 糖尿病有關靶點預測 通過GeneCards、OMIM、TTD、DrugBank 數據庫獲取糖尿病潛在疾病靶點1 030 個。將藥材與疾病靶點映射后，獲得74 個石斛合劑抗糖尿病的潛在作用靶點，繪制韋恩圖，見圖1。

圖1 石斛合劑治療糖尿病靶點韋恩圖

2.3 構建PPI 網絡 經STRING 平臺獲取石斛合劑抗糖尿病作用靶點的相互作用關系，通過Cytoscape 3.7.2 制作網絡圖，如圖2 所示。包括73 個節點與551 條邊，按照度值從大到小排序，以度值、介數、緊密度的平均數為條件，篩選PPI 網絡圖的核心靶點，共獲得14 個核心靶點，包含白蛋白（ALB）、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1（Akt1）、促生長因子（IGF1）、表皮生長因子受體（EGFR）、過氧化物酶體增生激活受體γ（PPARG）、雌激素受體α（ESR1）、過氧化物酶體增生激活受體α（PPARA）、內皮一氧化氮合成酶（NOS3）、絲裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）、血管緊張素轉換酶（ACE）等，推測其在石斛合劑治療糖尿病中具有重要地位。

圖2 石斛合劑治療糖尿病的靶點基因蛋白互作網絡圖

2.4 GO 功能富集分析 利用DAVID 數據庫對靶點進行GO 富集分析（P＜0.05），其中，生物過程（BP）相關條目179 條，生物過程主要涉及凋亡過程的負調控、類固醇激素介導的信號通路、細胞對胰島素的刺激反應等生物過程；分子功能（MF）相關條目58 條，分子功能包括類固醇激素受體活性、相同的蛋白質結合、藥物結合等；細胞組分（CC）相關條目16 條，細胞組成包括細胞外間隙、胞外區、胞外外泌體等部位。按照顯著程度進行排名，篩選各排名前10 的結果，利用微生信網站繪制柱形圖，見圖3。

圖3 石斛合劑對于治療糖尿病的GO 富集分析

2.5 KEGG 通路分析 利用DAVID 數據庫對靶點進行KEGG 富集分析（P＜0.05），共得到80 條通路及其有關信息，選定P值較小的前20 條顯著通路，利用微生信網站繪制氣泡圖，結果見圖4。KEGG結果中FoxO 信號通路、胰島素信號通路、PI3K/Akt信號通路等與糖尿病相關性較強，可能作為石斛合劑抗糖尿病的重要通路。

圖4 石斛合劑對于治療糖尿病的KEGG 富集分析

2.6 成分-靶點-通路網絡圖的構建 利用軟件Cytoscape 3.7.2 構建石斛合劑“成分-靶點-通路”網絡圖，該網絡圖由291 個節點，3 736 條邊構成，見圖5。對網絡圖進行拓撲分析，以度值、介數、緊密度的平均數作為核心成分篩選條件，共篩選得到39 個核心成分。核心成分包括表小檗堿（HL8）、新隱丹參酮Ⅱ（DS48）、小檗紅堿（HL7）、五味子乙素（WWZ11）、刺芒柄花素（D）、小檗堿（HL4）等。

圖5 石斛合劑的成分-靶點-通路圖

2.7 分子對接驗證 選取出PPI網絡圖中度值排名前6 的核心靶點（ALB、Akt1、IGF1、EGFR、PPARG、ESR1）與成分-靶點-通路圖中核心成分度值排名前3 的表小檗堿、新隱丹參酮Ⅱ、小檗紅堿，利用AutoDock 軟件進行結合能力預測，將活性成分與靶蛋白對接，發現除小檗紅堿與PPARG 對接結合能＞-5.0 kcal/mol 外其余結合能均＜-5.0 kcal/mol，見表2。將最佳對接構象進行PyMol 可視化結果展示，以表小檗堿為例，見圖6。

表2 石斛合劑治療糖尿病的核心成分與關鍵靶點的分子對接結果

3 討 論

本研究結果顯示，石斛合劑可能通過FoxO 信號通路、胰島素信號通路、PI3K/Akt 信號通路等發揮對糖尿病的治療作用，通過對核心靶點與通路的分析，得出其主要通過調節胰島素敏感、降低胰島素抵抗、加速糖脂代謝等方式對糖尿病進行調控，同時還可能對糖尿病的并發癥，如糖尿病認知功能障礙、改善糖尿病骨骼肌萎縮等具有治療作用。

通過PPI 網絡分析了石斛合劑成分潛在靶點與糖尿病靶點的交集靶點，得到了石斛合劑抗糖尿病的核心靶點，其中包括Akt1、IGF1、PPARG 等。其中Akt1 是Akt 基因的產物，被稱為Akt 激酶，在人體中具有調節葡萄糖代謝的作用［6］。在機體缺乏胰島素時，Akt 可通過刺激胰島素反應型葡萄糖轉運蛋白4 向質膜轉移，從而誘導細胞攝取葡萄糖［7］。IGF1 名為胰島素樣生長因子，在機體中可改善葡萄糖耐量與胰島素敏感性［8］。IGF1 還可通過IGF1/IGF1R 通路作用于甲狀腺激素，加速糖脂代謝［9］。PPARG 是一個來自配體激活核激素受體家族的轉錄因子，它在被激活時調節多種代謝途徑，包括脂質生物合成和葡萄糖代謝［10］。在多項研究中，該靶點的激活與胰島素增敏和脂質代謝的調節直接相關［11-12］。在前期對于石斛合劑的研究中，其可以降低糖尿病大鼠血糖、甘油三酯、膽固醇水平，提高胰島素水平，提高組織攝取葡萄糖的能力，降低肝糖原的釋放，并調節Wnt 信號通路減少脂肪積累，促進脂肪分解［13-14］。

圖6 分子對接模式圖

糖尿病腦病是糖尿病的一種常見并發癥，其常表現為認知功能障礙［15］。Akt1 在人體中也具有調節神經細胞的作用，有研究證明其可通過PI3K/Akt1/mTOR/CREB 通路對阿爾茨海默病大鼠淀粉樣蛋白損傷的海馬神經元具有潛在的神經保護作用［16］。PPARG 也具有重要的免疫調節和神經保護作用［17］。因此，本研究預測，石斛合劑可作用于這些與代謝有密切相關的Akt1、IGF1 與PPARG 等靶點對糖尿病的糖脂代謝、胰島素抵抗等過程進行干預，同時也可能通過PPARG 和Akt1 等靶點對其糖尿病腦病有起到治療作用。

FoxO 信號通路是治療糖尿病及其并發癥的通路之一。該通路的一個中心調節機制是由PI3K/Akt 途徑激活，從而影響胰島素通路［18］，改善糖脂代謝和胰島素抵抗［19］。同時還具有改善糖尿病心肌損傷［20］、改善糖尿病骨骼肌萎縮［21］、調控糖尿病認知功能障礙［22］等作用。而Akt 作為PI3K/Akt 通路成員，經研究證明在進餐后分泌胰島素可激活該信號通路增加葡萄糖的利用，減少糖異生，調控PI3K/Akt 信號通路及其下游分子是糖尿病極有前景的治療靶點［23］。胰島素信號通路包括InsR/IRS-1通路或者直接獨立于IRS-1 激活RAS/MAPK 通路［24］。其中IRS-1 可通過PI3K/Akt 通路起到促進胰島素影響葡萄糖代謝與脂質代謝。胰島素抵抗是糖尿病的原因之一，而骨骼肌胰島素通路蛋白表達降低容易導致IR 的發生［25］。胰島素信號通路還可以通過InsR/IRS-1/PI3K/GLUT4 影響骨骼肌對于葡萄糖的攝取，改善胰島素抵抗［26］。

通過成分-靶點-通路網絡圖篩選出石斛合劑治療糖尿病核心成分包括表小檗堿、新隱丹參酮Ⅱ、小檗紅堿等，其中表小檗堿和小檗紅堿主要存在于黃連中，新隱丹參酮Ⅱ主要存在于丹參中。通過分子對接結果可知表小檗堿、新隱丹參酮Ⅱ、小檗紅堿與核心靶點對接關系良好。PI3K/Akt 信號通路在KEGG 富集分析結果中與多條通路作用有關，該通路起到調節胰島素分泌和血糖等作用，且分子對接結果顯示石斛合劑中核心成分之一的新隱丹參酮Ⅱ與該通路成員（Akt1、IGF1、EGFR、PPARG 等）具有較強的結合活性，可將該通路作為石斛合劑抗糖尿病的主要通路進行深入研究。

糖尿病在中醫學上被稱為“消渴”，基本病機為陰津虧損、燥熱偏盛，而石斛合劑具有滋陰益氣、清熱潤燥、補腎活血的功效，方中石斛中潤胃陰，下滋腎陰，滋而不膩；黃芪氣陰雙補，利水消腫；丹參能夠通腎化瘀；知母和黃連清泄肺胃；五味子斂肺滋腎生津，寧心澀精；葛根升發脾胃清陽，生津止渴［27-28］。本實驗篩選結果表明，該方的核心成分主要存在于丹參、黃連和五味子中，它們能夠清泄肺胃、補腎化瘀、滋陰生津，在石斛合劑治療糖尿病中起到了重要作用，成分-靶點-通路網絡圖篩選結果也證明了這點。

綜上所述，本研究結果表明：石斛合劑可能基于FoxO 信號通路、胰島素信號通路、PI3K/Akt 信號通路等核心信號通路，以及調控Akt1、IGF1、PPARG等重要靶點之間相互協同作用，從而發揮治療糖尿病及其并發癥的作用。