結(jié)合分枝桿菌感染者輔助性Th2 型細(xì)胞因子IL-4、IL-6、IL-10 的水平變化

楊曉悅，李毓龍，羅仲秋，朱紫衣

（簡(jiǎn)陽(yáng)市人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)科，四川 簡(jiǎn)陽(yáng) 641400）

結(jié)核病（tuberculosis）是由結(jié)核分枝桿菌（mycobacterium tuberculosis，Mtb）感染引起的一種嚴(yán)重威脅人類健康的傳染病，已成為全世界成人因傳染病而死亡的主要疾病之一[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2017 年全球約有1000 萬(wàn)人感染結(jié)核分枝桿菌160 萬(wàn)人死于結(jié)核病[2]。我國(guó)是全球15 個(gè)結(jié)核高負(fù)擔(dān)國(guó)家之一，結(jié)核病人數(shù)位居世界第2[3]。結(jié)核病是我國(guó)法定乙類傳染病之一，2020 年度全國(guó)報(bào)告發(fā)病數(shù)位居乙類傳染病第2，報(bào)告死亡數(shù)位居第3[4]。結(jié)核分枝桿菌屬于胞內(nèi)寄生菌，機(jī)體抗結(jié)核免疫主要是以T 淋巴細(xì)胞免疫為主的細(xì)胞免疫。T 淋巴細(xì)胞是高度異質(zhì)性群體，根據(jù)發(fā)育過(guò)程中的出現(xiàn)分化抗原不同分為CD4+T 和CD8+T。根據(jù)表面標(biāo)志及功能的不同可將CD4+T 細(xì)胞分為輔助性T 細(xì)胞、Th17 細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞[5]。CD4+Th 細(xì)胞按其所產(chǎn)生的細(xì)胞因子譜的不同，可分為Th1 型和Th2 型細(xì)胞。故機(jī)體細(xì)胞因子可以大致分為兩類，一類主要由Th1 細(xì)胞產(chǎn)生包括腫瘤壞死因子α（TNF-α）、干擾素r（INF-r）、白細(xì)胞介素2（IL-2）等促進(jìn)細(xì)胞免疫，稱為Th1 型；另一類主要由Th2 型細(xì)胞產(chǎn)生包括IL-4、IL-6、IL-10 等促進(jìn)肥大細(xì)胞和嗜酸粒細(xì)胞的活化與增殖，主要參與體液免疫反應(yīng)，稱為Th2型[6]。Th1 型細(xì)胞因子主要激活單核巨噬細(xì)胞，Th2 型細(xì)胞因子抑制Th1 型細(xì)胞因子的產(chǎn)生，前者增加巨噬細(xì)胞的抗菌活性，因而對(duì)結(jié)核桿菌感染起到保護(hù)性免疫應(yīng)答作用，有利于疾病的控制，后者降低巨噬細(xì)胞的抗菌活性，使結(jié)核病的免疫應(yīng)答減弱，促進(jìn)了疾病的發(fā)展[7]。Th1 型/Th2 型的動(dòng)態(tài)平衡是機(jī)體有效控制結(jié)核感染的根本保證，若此種平衡一旦被打破，則將導(dǎo)致結(jié)核病的發(fā)生與發(fā)展。對(duì)結(jié)核病細(xì)胞因子的研究不僅在于了解結(jié)核免疫發(fā)病機(jī)制，恰當(dāng)?shù)貙?duì)這些細(xì)胞因子進(jìn)行干預(yù)，可為結(jié)核病的預(yù)防和治療開辟新的途徑。為此，本研究通過(guò)檢測(cè)結(jié)核患者、隱性結(jié)核桿菌感染者及健康人群的Th2 型細(xì)胞因子IL-4、IL-6、IL-10 的水平，以篩選隱性感染者，旨在早期開展針對(duì)性治療和防護(hù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取簡(jiǎn)陽(yáng)市人民醫(yī)院2020 年2 月-2021 年2 月收治的結(jié)核患者30 例作為活動(dòng)性結(jié)核患者組（ATB 組）。納入標(biāo)準(zhǔn)：①痰涂片抗酸染色陽(yáng)性或結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)陽(yáng)性或結(jié)核感染T 細(xì)胞檢測(cè)陽(yáng)性（TB-IGRA）且有明確的活動(dòng)性臨床表現(xiàn)及診斷者；②均符合2001 年中華醫(yī)學(xué)會(huì)結(jié)核病學(xué)分會(huì)《肺結(jié)核診斷和治療指南》的診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]；③年齡、性別、民族不限。排除標(biāo)準(zhǔn)：①腫瘤、HIV 感染、免疫系統(tǒng)功能紊亂、基礎(chǔ)代謝障礙的患者；②患有其他基礎(chǔ)疾病。ATB 組中男22例，女8 例；年齡23～78歲，平均年齡（42.20±16.87）歲。選取結(jié)核潛伏感染者30例作為結(jié)核潛伏感染者組（LTBI 組）：痰涂片抗酸染色陰性性或結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)陰性性、并結(jié)核感染T 細(xì)胞γ 干擾素釋放試驗(yàn)陽(yáng)性（TB-IGRA）且有無(wú)明確的活動(dòng)性臨床表現(xiàn)及診斷者，其中男19例，女11 例；年齡25～78歲，平均年齡（49.92±17.69）歲。選取健康對(duì)照者30 例作為對(duì)照組，均為本院體檢標(biāo)本，各實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)指標(biāo)均無(wú)異常；無(wú)可能干擾實(shí)驗(yàn)的既往疾病，如既往感染結(jié)核等；無(wú)當(dāng)前可能干擾實(shí)驗(yàn)的疾病，如肺部感染等；TB-IGRA 試驗(yàn)陰性。對(duì)照組中男20例，女10 例；年齡25～72歲，平均年齡（45.31±14.14）歲。三組研究對(duì)象無(wú)血緣關(guān)系，性別、年齡比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。本研究經(jīng)我院倫理委員會(huì)審批通過(guò)，患者及其家屬均知情同意且已簽署知情同意書。

1.2 材料與儀器 血標(biāo)本：納入者樣本收集于臨床“結(jié)核感染T 細(xì)胞檢測(cè)”項(xiàng)目。儀器：臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（5417C）：德國(guó)Eppendorf 公司；WH-1 微型漩渦混合器：上海滬西分析儀器廠；液相懸浮芯片儀：Luminex 200analyzer。試 劑：Huaman Premixed Multi-Analyte Kit（Lot: LXSAHM）購(gòu)置R&D systems；結(jié)核感染T 細(xì)胞檢測(cè)免疫試劑盒購(gòu)自北京萬(wàn)泰生物藥業(yè)股份有限公司；細(xì)胞因子檢測(cè)試劑：MILLIPLEXMAP 多因子檢測(cè)試劑盒。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本收集與保存 三組樣本收集于臨床“結(jié)核感染T 細(xì)胞檢測(cè)”項(xiàng)目，具體步驟如下：取抗凝全血（肝素鈉，BD），于采血后2 h 內(nèi)分裝入N、T、P 三管各1 ml（N 管為陰性對(duì)照管；T 管為檢測(cè)管，內(nèi)有結(jié)核特異性抗原即ESAT-6/CFP-10 復(fù)合物；P 管為陽(yáng)性對(duì)照管，內(nèi)有非特異性抗原植物血凝素即PHA）；37 ℃溫育（22±2）h，3500 r/min 離心10 min，上機(jī)做ELISA 檢測(cè)IFN-γ 水平；收集N 管和T 管中剩余的樣本，N 管作為結(jié)核特異性抗原ESAT-6/CFP-10 復(fù)合物刺激前樣本，T 管作為結(jié)核特異性抗原刺激后樣本。分別吸取N 管和T 管中的血漿于EP 管中，標(biāo)記，凍存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 檢測(cè)技術(shù) 液相懸浮芯片技術(shù)（magnetic luminex screening assay）：液相芯片的核心技術(shù)是微球，微球分別被不同配比的熒光染色（xMAP 技術(shù)），然后再把針對(duì)不同檢測(cè)物的寡核苷酸或蛋白質(zhì)探針以共價(jià)結(jié)合的方式吸附到不同顏色的微球上。在不同熒光編碼的微球上進(jìn)行抗原-抗體、酶-底物、配體-受體的結(jié)合反應(yīng)及核酸雜交發(fā)硬，通過(guò)紅、綠兩束激光分別檢測(cè)微球編碼（Region）和報(bào)告熒光來(lái)達(dá)到定性和定量的目的。使用液相懸浮芯片系統(tǒng)（美國(guó)Luminex 公司）檢測(cè)血漿中的IL-4、IL-6、IL-10 的水平（MILLIPLEXMAP 多因子檢測(cè)試劑盒）。所有操作均按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行，血漿根據(jù)待測(cè)蛋白濃度進(jìn)行不同比例的稀釋，每個(gè)樣本均設(shè)置復(fù)孔，并且同時(shí)設(shè)置高、低濃度質(zhì)控對(duì)照。讀取樣本熒光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合及稀釋比例計(jì)算血漿中每種炎癥因子的實(shí)際濃度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 本研究所有細(xì)胞因子的表達(dá)水平均不服從正態(tài)分布，使用GraphPad prism 5.0 進(jìn)行Kruskal-wallis test 進(jìn)行檢驗(yàn)，使用ROC 曲線進(jìn)行靈敏度和特異性的檢測(cè)，取95%為置信區(qū)間。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組各項(xiàng)指標(biāo)比較 ATB 組、LTBI 組、對(duì)照組IL-4 水平依次增高，其中ATB 組IL-4 水平低于LTBI 組和對(duì)照組，且LTBI 組IL-4 水平低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；TB 組、LTBI 組、對(duì)照組IL-6 水平依次降低，其中ATB 組IL-6 水平高于LTBI組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；ATB組和LTBI 組IL-6 水平均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；ATB 組、LTBI 組、對(duì)照組IL-10 水平依次增高，其中ATB 組IL-10 水平低于LTBI 組和對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；LTBI 組IL-10 水平低于對(duì)照組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖1。

圖1 三組各項(xiàng)指標(biāo)比較

2.2 IL-10、IL-4 鑒別診斷ATB 和LTBI的價(jià)值ROC 曲線顯示，IL-4 鑒別診斷ATB 與LTBI 的AUC值為0.76，IL-10 鑒別診斷ATB 與LTBI 的AUC 值為0.80，見圖2。

圖2 IL-10、IL-4 鑒別診斷ATB 和LTBI 的價(jià)值

3 討論

結(jié)核病目前是全球最常見和最重要的感染性疾病之一。近年來(lái)，由于耐藥菌株的出現(xiàn)、流動(dòng)人口的增加以及艾滋病（AIDS）患者的增多等導(dǎo)致結(jié)核病，尤其是耐藥結(jié)核病難以得到有效治療，結(jié)核病的發(fā)病率和死亡率呈上升趨勢(shì)，現(xiàn)已成為僅次于AIDS最常見的引起死亡的感染性疾病[9，10]。

本研究發(fā)現(xiàn)，IL-4 在ATB 組、LTBI 組和對(duì)照組中濃度依次升高。大量研究表明[11-13]，IL-4 在結(jié)核相關(guān)性疾病中呈顯著性高表達(dá)狀態(tài)，參與機(jī)體抗結(jié)核的免疫調(diào)節(jié)。IL-6 能誘導(dǎo)B 細(xì)胞分化和產(chǎn)生抗體，并誘導(dǎo)T 細(xì)胞活化增殖、分化,參與機(jī)體的免疫應(yīng)答，是炎性反應(yīng)的促發(fā)劑[14]。IL-6 的表達(dá)一般與肺結(jié)核的疾病嚴(yán)重程度及疾病進(jìn)展顯著相關(guān)[15]。本研究中ATB 組、LTBI 組、對(duì)照組IL-6 水平依次降低，這可能是由于隱性感染者病變程度低于結(jié)核患者，結(jié)核患者的病變程度相對(duì)較高的緣故[16]。IL-10 為有免疫抑制作用的細(xì)胞因子，對(duì)Th1 細(xì)胞的免疫應(yīng)答有制約作用，還能促進(jìn)IL-2 因子快速合成。IL-10可降低Th1 細(xì)胞的生物活性，使巨噬細(xì)胞的功能降低，同時(shí)還能夠抑制IL-6 生成，抑制機(jī)體的免疫反應(yīng)[17，18]。本研究中ATB 組、LTBI 組、對(duì)照組IL-10 水平依次升高。已有研究指出[19]，外周血IL-10 水平表達(dá)異常對(duì)重癥結(jié)核患者死亡預(yù)后具有一定的預(yù)測(cè)價(jià)值。本研究還通過(guò)ROC 曲線分析IL-4 和IL-10 鑒別診斷ATB 和LTBI 的價(jià)值，其中IL-4 診斷的AUC值為0.76，IL-10 的診斷AUC 值為0.80，兩項(xiàng)指標(biāo)均可用于ATB 和LTBI 的鑒別診斷，可見檢測(cè)IL-4、IL-10 的水平可作為在細(xì)胞因子水平區(qū)分活動(dòng)性結(jié)核與潛伏性結(jié)核患者的指標(biāo)。

綜上所述，IL-4、IL-10 在活動(dòng)性結(jié)核與潛伏性結(jié)核病中有差異，可以區(qū)分活動(dòng)性感染者和潛伏性感染者，對(duì)輔助鑒別診斷結(jié)核現(xiàn)癥感染和潛伏性感染有重要的意義，有利于結(jié)核病的早發(fā)現(xiàn)、早治療。