白藜蘆醇抑制TLR4/NF-κB通路對毛細支氣管炎小鼠的保護作用

高凱霞 吳福玲 石 濤 高 萌 張雪靜 秦英飛 鄺哲姝

濱州醫學院附屬醫院兒科(濱州 256600)

毛細支氣管炎多由呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus，RSV)感染引起，常見于2～6月嬰幼兒，臨床特點主要表現為喘息、三凹征、氣促[1]。目前的治療方案以抗感染、控制喘息等對癥支持治療為主，尚無特異性治療方法。RSV毛細支氣管炎涉及到由多種細胞和細胞因子參與的固有免疫應答和適應性免疫應答[2]。其中Toll樣受體(Toll-like receptors, TLRs)，特別是TLR3、TLR4、TLR7等受體及其銜接蛋白與RSV感染關系密切[3]。而NF-κB是一種核轉錄因子，具有多種生物學活性，NF-κB途徑可調節與喘息相關的呼吸道炎癥基因，抑制NF-κB活性可減輕氣道炎癥反應，從而改善氣道重塑[4]。已有相關研究表明，機體感染 RSV 后可激活TLR3通路，進而激活NF-κB，通過信號傳導，引起下游炎性細胞因子的過度表達，加重氣道炎癥反應[5]。白藜蘆醇(resveratrol，Res)是一種非黃酮類多酚有機化合物，廣泛存在于葡萄、虎杖等70多種植物中，口服容易吸收，可隨尿液、糞便代謝排出，其具有抗炎、抗過敏、抗氧化、抗腫瘤等多種生物學作用[6]。近年來，白藜蘆醇的有益作用已在哮喘、肺纖維化、肺動脈高壓和其他肺部疾病中被證明[7-8]。而TLR4與毛細支氣管炎相關的具體機制仍不完全清楚。本文通過建立毛細支氣管炎小鼠模型并予白藜蘆醇干預，來探討白藜蘆醇對毛細支氣管炎小鼠肺組織TLR4/NF-κB通路的調控作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 試劑 白藜蘆醇、BCA蛋白濃度測定試劑盒購自Solarbio；兔抗鼠多克隆抗體GAPDH、TLR4及NF-κB購自武漢三鷹公司；胎牛血清購自四季青公司；小鼠白介素- 6(interleukin，IL- 6)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)試劑盒為上海朗頓公司產品。

1.1.2 制備RSV病毒 RSV A2株由山東省病毒研究所饋，將液氮凍存人宮頸癌 (Hela) 細胞復蘇后，用含 10%培養液常規傳代培養。將病毒懸液接種于Hela細胞，在37 ℃、2%FBS培養基中培養，至80%細胞發生病變時反復凍融，1 000 r、5 min 收集RSV病毒懸液，空斑實驗檢測病毒滴度。

1.1.3 實驗動物 選取30只6～8周齡18～22 g B/C雄性小鼠，購自朋悅實驗動物繁育有限公司，許可證號：SCXK(魯) 2019-0003，由濱州醫學院附屬醫院動物房分籠飼養適應1周。

1.2 方法

1.2.1 分組造模 將30只小鼠隨機分為對照組、RSV組及給藥組(白藜蘆醇25 mg/kg)[9]，每組小鼠10只。RSV組和給藥組均予RSV病毒懸液滴鼻100 μL/天，連續2天[10]，對照組予100 μL 磷酸鹽緩沖液(PBS)滴鼻2天對照；給藥組滴鼻2小時后予白藜蘆醇25 mg/kg、0.2 mL腹腔注射，連續3天。對照組和RSV組滴鼻2小時后予0.2 mL PBS腹腔注射，連續3天。造模過程中無小鼠死亡。

1.2.2 收集肺泡灌洗液 (bronchoalveolar lavage fluid，BALF) 造模結束后第2天進行取材，5%水合氯醛(劑量0.1 mL/10 g)麻醉小鼠，充分暴露氣管，用1 mL 灌洗液灌洗氣管，重復抽吸3次，確保回收量大于0.8 mL，低溫高速離心取上清液，-20 ℃ 冰箱保存。

1.2.3 肺組織病理觀察 采取頸部脫臼法處死小鼠，剝離小鼠肺組織，取右肺中葉用10%多聚甲醛灌注固定48小時，用升序蔗糖脫水，包埋劑包埋，冰凍切片機切片，厚度約5 μm，切片后固定，固定時間為30 s～1 min，清水稍沖洗1～2 s。蘇木素染色，時間大概為3～5 min；然后清水洗去蘇木素，大概5～10 s。促藍液返藍5～10 s；清水稍沖洗1～2 s。伊紅染色10～20 s，然后脫水、透明、中性樹膠封固。400倍光鏡下觀察。

1.2.4 ELISA法測定 BALF中IL- 6、TNF-α的水平 按照試劑盒說明書步驟檢測BALF中IL- 6、TNF-α的含量，根據標準品做出標準曲線，計算各組炎性因子水平變化。

1.2.5 Western blot 檢測各組小鼠肺組織中TLR4、NF-κB蛋白水平 用勻漿器提取肺組織蛋白，BCA法測蛋白濃度，根據蛋白分子量大小值配膠，上樣量為50 g進行電泳，將蛋白轉膜，用5%脫脂奶粉封閉2小時，一抗(兔抗鼠多克隆抗體TLR4 1:1 000、兔抗鼠多克隆抗體NF-κB 1:1 000、兔抗鼠多克隆抗體GAPDH 1:5 000) 4 ℃冰箱孵育過夜，TBST 洗膜3次，10分鐘/次，搖床孵育二抗(辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔 IgG 1:5 000)2小時，TBST 洗膜3次，10分鐘/次，于暗室曝光。分析軟件分析條帶吸光度值(A值) 。結果用A TLR4/A GAPDH、A NF-κB /A GAPDH表示。

1.2.6 逆轉錄-定量PCR(RT-qPCR)檢測TLR4 mRNA、NF-κB mRNA表達 將肺組織(100 mg)加入1mL Trizol研磨勻漿，提取總RNA。總RNA根據PrimeScript RT試劑盒的說明進行逆轉錄。使用SYBR?-Green Master Mix(Takara Bio，Inc.)進行qPCR。根據制造商的方案；在推薦的參數下進行擴增：在94 ℃的初始變性3 min，擴增40個循環，94 ℃ 20 s，55 ℃ 15 s和72 ℃ 25 s，最后在94 ℃延伸20 s。用2-ΔΔCT法計算目的基因的表達水平。

基因名稱序列大小引物序列(5'→3')TLR4 310 F:GGTGAGAAATGAGCTGGTAR:TCTGCTAAGAAGGCGATANF-κB425F:GCGCATCCAGACCAACAATAACR:GCCGAAGCTGTGGACACTGAPDH526F:CCACTTGAAGGGTGGAGCR: TGAAGTCGCAGGAGACAA

1.3 統計分析

2 結 果

2.1 小鼠BALF中IL- 6、TNF-α的水平

RSV組炎性因子水平升高，給藥組可降低毛細支氣管炎小鼠BALF中炎癥因子水平。ELISA結果顯示，對照組小鼠BALF中IL- 6的表達量為(12.26±6.25)pg/mL；RSV組小鼠BALF中IL- 6的表達量為(95.63±8.32)pg/mL，高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)；給藥組小鼠BALF中IL- 6的表達量為(54.32±10.42)pg/mL，較RSV組降低，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖1。對照組小鼠B中TNF-α的表達量為(27.58±6.37)pg/mL；RSV組小鼠BALF中TNF-α的表達量為(57.23±16.45)pg/mL，高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)；給藥組小鼠BALF中TNF-α的表達量為(42.36±17.43)pg/mL，較RSV組降低，差異有統計學意義(P<0.05)，如圖2。

圖1 ELISA法測小鼠BALF中IL- 6表達量

圖2 ELISA法測小鼠BALF中TNF-α表達量

2.2 小鼠肺組織病理學表現

白藜蘆醇治療可減輕毛細支氣管炎小鼠模型的病理損害。對照組肺組織肺泡結構無明顯變化，支氣管周圍炎癥細胞浸潤不明顯，黏膜結構、肺泡組織無明顯變化(圖3A)。與對照組相比，RSV組肺組織病理改變明顯，表現為支氣管黏膜增厚，氣道狹窄，多發炎性細胞浸潤，氣管平滑肌增厚，還觀察到明顯的毛細血管充血、肺泡融合擴大和肺泡間隔增寬(圖3B)。與RSV組比較，給藥組肺組織病理改變較輕，支氣管黏膜增厚較輕，炎癥細胞浸潤較少(圖3C)。

圖3 小鼠肺組織病理改變(HE染色，×400)

2.3 肺組織中TLR4、NF-κB蛋白的表達水平

RSV組較對照組小鼠肺組織中TLR4、NF-κB蛋白表達升高(P<0.05)，給藥組TLR4、NF-κB蛋白表達較RSV組降低，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖4、圖5。

圖4 Western blot 檢測肺組織 TLR4蛋白變化

圖5 Western blot 檢測肺組織NF-κB蛋白變化

2.4 肺組織中TLR4 mRNA、NF-κB mRNA的表達水平

實驗設定對照組TLR4 mRNA表達量為1.00；RSV組TLR4 mRNA相對表達量為(3.732±0.75)，較對照組小鼠表達升高(P<0.05)；白藜蘆醇給藥組TLR4 mRNA相對表達量為(1.494±0.34)，較RSV組降低，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖6。

圖6 RT-PCR檢測各組小鼠肺組織中TLR4 mRNA的表達

實驗設定對照組NF-κB mRNA表達量為1.00；RSV組NF-κB mRNA相對表達量為(6.634±0.97)，較對照組小鼠表達升高(P<0.05)；給藥組NF-κB mRNA相對表達量為(4.128±0.52)，較RSV組降低，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖7。

圖7 RT-PCR檢測各組小鼠肺組織中NF-κB mRNA的表達

3 討 論

毛細支氣管炎多由RSV病毒感染引起[11]。它起病急、病情發展快，嚴重者可出現煩躁不安、紫紺甚至呼吸衰竭等表現，危害幼兒健康[12]。研究表明，炎癥反應不僅促進該病的發生發展，還能降低兒童免疫反應，增加其他并發癥[13]。因此，毛細支氣管炎的治療不僅需要減輕炎癥反應，還需減少氣道腺體分泌和增強機體免疫能力。

TLRs屬于進化保守的模式識別蛋白，啟動和調節先天免疫反應，到目前為止已被證明具有功能的10個人類TLR中的每一個都能識別不同的分子模式[14]。TLRS在RSV感染過程中發揮著重要的作用，是研究RSV感染的新的方向。機體感染RSV后激活TLRs通路，進而激活NF-κB，從而導致前炎性細胞因子(TNF-α、IL-1β、IL- 6、IL-8等)過度表達[15]，這些生物活性介質，使氣道呈現高反應，加重氣道局部炎癥，威脅患兒身體健康。實驗證明，用脂多糖感染小鼠導致肺炎后，可激活TLR4信號，導致活化NF-κB表達和促炎細胞因子TNF-α、IL-1β和IL- 6的產生[16]。實驗研究表明，RSV感染機體后可促使肺泡巨噬細胞分泌大量TNF-α，且分泌量與感染嚴重程度有關[17]。本實驗中檢測RSV毛細支氣管炎小鼠BALF中IL- 6、TNF-α水平高于空白對照組，肺組織中TLR4、NF-κB蛋白水平及mRNA水平高于空白組，提示RSV感染小鼠后可能是激活TLR4/NF-κB信號通路激發炎癥反應，并與以上實驗數據相統一。

我們現在知道TLR4能夠感知各種微生物結構，包括RSV的融合F蛋白[18]。TLRs家族中的TLR4可與抗原結合迅速，并通過激活相關激酶向下游傳遞信號發揮其功能，是激活炎癥通路和合成、分泌高水平炎癥介質的啟動因素[19]。何月賢等[20]通過收集121例毛細支氣管炎患兒，均由RSV感染導致，研究發現觀察組血清TLR4、TGF-β1水平高于對照組，且升高的程度影響病情的嚴重程度。實驗結果提示血清中TLR4、轉化生長因子-β1表達上調通過介導免疫應答反應和炎癥反應而參與發病過程，并影響疾病嚴重程度。我們實驗中通過構建毛細支氣管炎小鼠模型，檢測小鼠肺組織中TLR4蛋白、TLR4 mRNA較空白對照組明顯升高，與上述何月賢檢測患兒血清研究結果一致，這表明了TLR4參與了毛細支氣管炎的發病和發展過程。

白藜蘆醇是一種多酚化合物，存在于多種藥用植物中。隨著研究進展，發現白藜蘆醇生物活性較多，尤其在免疫調節、抗病毒、抗炎等方面作用顯著[21]。白藜蘆醇可以通過干擾免疫細胞調節、促炎細胞因子的合成和基因表達來調節免疫[22]。白藜蘆醇最顯著的作用是減輕炎癥，主要是通過調節NF-κB途徑實現[23]。李明等[24]通過RSV滴鼻感染小鼠建立肺炎模型，研究低、中、高劑量白藜蘆醇給藥組肺組織炎癥因子水平，說明白藜蘆醇可以改善RSV引起的肺部炎癥反應，并具有劑量依賴性。故本實驗中給藥組選取最佳給藥劑量25 mg/kg給藥，檢測各組小鼠BALF中TNF-α、IL- 6因子的水平，得出白藜蘆醇可以減輕毛細支氣管炎小鼠肺內炎癥，這與以上實驗結果一致。

本研究中，給藥組小鼠喘息癥狀及肺泡灌洗液中IL- 6 、TNF-α水平較RSV組明顯下降。說明白藜蘆醇可以抑制毛細支氣管炎小鼠肺內的炎癥反應，減少炎癥因子的釋放，進而改善預后。同時實驗得出，給藥組小鼠肺組織中TLR4、NF-κB 的蛋白表達水平及 TLR4 mRNA、NF-κB mRNA的表達水平均比RSV組低，進一步明確了白藜蘆醇對毛細支氣管炎小鼠抑制的保護機制可能是通過抑制 TLR4介導的炎癥通路實現的。

綜上，白藜蘆醇能明顯改善毛細支氣管炎小鼠的癥狀，減輕肺內炎癥反應，降低炎癥因子含量和肺組織中TLR4、NF-κB的表達，從而發揮對毛細支氣管炎小鼠的保護作用，證實該保護作用可能是通過抑制TLR4/NF-κB通路介導的免疫炎癥反應實現的。