m6A甲基化修飾在腫瘤免疫中的作用及干預策略

彭彥茜 易 誠 陶麗君 王紅勝

1 湘南學院基礎醫學院 (郴州 423000)

2 中山大學藥學院 (廣州 510006)

N6-甲基腺苷(N6-methyladenosine, m6A)是mRNA上豐度最高的修飾，其廣泛存在于原核和真核生物中[1]。m6A 已被證明對前體或成熟mRNA的剪接、運輸、定位、穩定性和翻譯效率具有廣泛的影響。此外，m6A修飾還參與了小RNA、lncRNA 和其他轉錄副產物的產生，是特異性調節 mRNA 和 miRNA基因功能的重要途徑[1- 2]。

m6A 的動態修飾主要依賴于三類相關蛋白，分別是甲基化酶、去甲基化酶和識別蛋白[3]。這三類蛋白以協調一致的方式共同工作，保持細胞內m6A 的穩態。RNA m6A甲基化酶主要為METTL3/14及WTAP，其功能是將甲基供體S-腺苷甲硫氨酸上甲基轉移到腺苷的N- 6位置，并催化RNA中形成m6A[4]，見圖1。FTO及同屬Alkb家族的ALKBH5被證實為RNA m6A去甲基化酶，可高表達于大腦、肺、肌肉及睪丸[5- 6]。m6A 識別蛋白主要是含有YTH 結構域的蛋白家族[7- 8]，分別是定位在細胞質的YTHDF1/2/3 和定位于細胞核中的YTHDC1/2等[2]。此外，在哺乳動物細胞中發現與m6A 關聯的蛋白還有IGF2BP、HuR及HNRNP 等諸多識別蛋白[1]。

圖1 m6A RNA修飾及其介導功能

近期研究表明，m6A修飾可以調節腫瘤微環境(tumor microenvironment, TME)中免疫細胞的浸潤、存活、分化或極化，促進腫瘤細胞的增殖和轉移，進而影響免疫治療的效果[2]。此外，m6A修飾在調控免疫細胞效應功能及相關的抗腫瘤免疫反應中發揮著重要作用[2]。目前，腫瘤免疫調節療法已發展成為一種癌癥治療的有效策略，基于表觀遺傳學的免疫治療新策略也被提出用于癌癥治療[2]。因此，靶向m6A甲基化修飾的干預策略在腫瘤免疫治療中具有重要潛在價值。本文將分別從m6A在免疫細胞及腫瘤免疫治療中作用進行闡述，從而為基于m6A甲基化修飾的腫瘤免疫治療提供新思路。

1 m6A修飾在免疫細胞中的作用

研究表明m6A在細胞分化過程中發揮重要調控作用。細胞分化是免疫細胞成熟及發生作用的重要過程，近期研究表明m6A修飾在免疫細胞如T細胞、B細胞、巨噬細胞、自然殺傷細胞、樹突狀細胞等分化過程中發揮重要調控作用，從而調控免疫系統功能及其在體內的作用。

1.1 T細胞

T細胞在胸腺中發育，當其成熟后可遷移到周圍器官構成適應性免疫系統的基礎，根據細胞表面受體CD4或CD8分為兩大類，在發生病毒感染和腫瘤細胞侵襲起重要的保護作用[9]。研究表明m6A修飾在T細胞分化和功能中具有重要調控作用。如METTL3的缺失會導致CD4+T細胞下調IL - 7介導的STAT5細胞因子信號抑制蛋白SOCS的激活，破壞T細胞的穩態和分化[10]。濾泡輔助性T細胞(T follicular helper, Tfh)是一種特化的CD4+T細胞亞群，對體液免疫至關重要[11]。在敲除METTL3的小鼠中，Tfh分化會受到嚴重阻礙，這可能是因為Tfh的重要特征基因Tcf7、Bcl6、Icos和CXCR5等的mRNA穩定性受METTL3調控所導致[12]。同時，在敲除METTL3的小鼠中會導致IL- 2/STAT5信號通路被抑制，調節性T細胞對效應T細胞的抑制功能喪失，從而增強TME中的抗腫瘤免疫應答[13]。此外，METTL3介導的環狀RNA circIGF2BP3的m6A可通過與識別蛋白YTHDC1結合增強其環化，從而上調PKP3表達并誘發PD-L1表達上調來抑制CD8+T細胞在腫瘤組織的浸潤及促進腫瘤細胞免疫逃逸[14]。以上證據表明m6A甲基轉移酶METTL3對T細胞功能及分化具有重要調控作用。

除METTL3外，多項研究表明m6A修飾的其它調控蛋白METTL14、ALKBH5、YTHDF1等的失調參與了對T細胞功能的調控。Dong等人[15]的研究發現，腫瘤基質中METTL14的表達量與m6A修飾水平及CD8+T細胞的浸潤呈正相關，METTL14的降低促使CD8+T細胞功能失調，最終促進腫瘤生長。小鼠模型中，T細胞METTL14缺失可使得調節性T細胞功能紊亂，從而導致自發性腸炎的顯著增加[16]。在CD4+T細胞中，m6A去甲基化酶ALKBH5缺乏可導致IFN-γ和CXCL2 mRNA的m6A增加，從而降低其mRNA穩定性及蛋白表達，從而導致進入中樞神經系統的中性粒細胞減少并減緩自身免疫性腦脊髓炎癥狀[17]。γδ T細胞在黏膜組織穩態和免疫調節中起著至關重要的作用，近期研究發現淋巴細胞中ALKBH5缺失可導致γδ T細胞顯著擴增，從而抑制胃腸道沙門傷寒菌感染，其機制可能是通過增加Notch信號元件Jagged1和Notch2等mRNA的m6A從而抑制其表達[18]。此外，Han等人報道了YTHDF1蛋白的缺失可以增強T細胞對腫瘤抗原的提呈作用，提高CD8+T細胞反應性，從而抑制小鼠腫瘤生長[17]。以上證據表明，m6A修飾在T細胞中的不同功能可能取決于細胞類型和細胞環境，其詳細作用及機制仍待進一步深入研究。

1.2 B細胞

B細胞主要來源于骨髓中的造血干細胞，響應抗原刺激而分化為漿細胞，合成和分泌免疫球蛋白，主要進行體液免疫。生發中心反應對產生記憶B細胞和長壽命的抗體分泌漿細胞至關重要，近期研究發現METTL14對生發中心 B細胞增殖及抗體反應至關重要，其主要機制是通過增加m6A修飾來降解負性免疫調控因子如Lax1和Tipe2的mRNA[19]。同時，METTL14的缺失可顯著降低B細胞mRNA m6A甲基化，從而阻礙B細胞發育，這一研究進一步證實了RNA m6A甲基化及其調節蛋白在早期B細胞發育中的重要調節作用[20]。利用Cd19-Cre(METTL CKO)在pro-B階段對METTL3進行條件性敲除，結果表明pro-B階段敲除METTL3對B細胞發育和功能以及肝纖維化中B細胞的前纖維化活性的影響極小，從而提示METTL3介導的B細胞發育可能具有階段依賴性[21]。

1.3 巨噬細胞

巨噬細胞是先天免疫的吞噬細胞系統主要參與病原體和腫瘤細胞的識別、吞噬和降解[22]。通過基于CRISPR文庫系統篩選，結果發現m6A甲基轉移酶在巨噬細胞活化過程發揮重要促進作用，METTL3缺失的巨噬細胞其LPS誘導產生的TNF-α顯著降低，其主要機制是通過抑制Irakm基因的mRNA甲基化從而抑制TLR信號誘導的巨噬細胞活化[23]。同時，識別蛋白IGF2BP2可通過穩定TSC1和PPARγ從而調控巨噬細胞活化，其缺失可促進右旋糖酐硫酸鈉誘導的結腸炎[24]。同時，干擾素調節因子1(IFN regulatory factor-1, IRF1)可通過上調環狀RNA circ_0029589的m6A甲基化從而抑制其表達，進而誘導巨噬細胞的焦亡[25]。在動脈粥樣硬化過程中，RNA結合蛋白Matr3可通過募集METTL3/14甲基復合物從而增加MAPK mRNA甲基化并導致其降解，從而抑制巨噬細胞介導的炎癥反應及動脈粥樣硬化進程[26]。

巨噬細胞高度參與腫瘤的發生和發展，特別是TME中的腫瘤相關巨噬細胞(tumor-associated macrophages, TAMs)非常具有可塑性，通常分為兩種功能相反的亞型即經典激活的 M1樣巨噬細胞和交替激活的 M2樣巨噬細胞。M1樣巨噬細胞能促炎和殺瘤，而M2樣巨噬細胞發揮免疫抑制和促進腫瘤生長的功能[27]。最近研究發現，METTL3可直接甲基化STAT1的mRNA并上調其mRNA穩定性與蛋白表達，從而促進巨噬細胞的M1極化[28]。在腫瘤組織中，干擾巨噬細胞的METTL3可增強重塑腫瘤微環境中M1樣和M2樣TAMs的浸潤，使其功能紊亂并招募調節性T細胞到腫瘤發生部位，同時METTL3缺陷小鼠對PD-1的治療響應程度顯著降低[29]。巨噬細胞缺乏METTL14可抑制CD8+T細胞抗腫瘤功能，促進腫瘤生長[30]。LncRNA-PACERR在胰導管腺癌中通過與miR- 671- 3p和m6A結合蛋白 IGF2BP2相互作用誘導腫瘤相關巨噬細胞向M2極化，促進細胞增殖、侵襲和遷移，從而促進胰腺癌的惡性進展[31]。以上證據提示m6A調節的巨噬細胞分化是腫瘤免疫治療重要潛在靶點。

1.4 NK細胞

自然殺傷細胞(natural killer cell, NK)是主要的固有免疫淋巴細胞，主要介導抗病毒和抗腫瘤免疫功能[32- 33]。已有文獻報道，YTHDF2介導的m6A甲基化在NK細胞免疫中的多面作用，對維持NK細胞內穩態、成熟、IL -15介導的生存以及抗腫瘤和抗病毒活性至關重要[34]。此外，Song 等人[35]觀察到，METTL3在腫瘤浸潤NK細胞中的表達下降，其蛋白表達水平與NK細胞中效應分子呈正相關。m6A甲基化酶METTL3和m6A結合蛋白YTHDF2均正向調節NK細胞的抗腫瘤免疫，因此m6A甲基化修飾可能是維持NK細胞抗腫瘤免疫和內穩態的重要調節因子。目前其它m6A調節蛋白對NK細胞的效應功能和調控機制尚不明確。

1.5 樹突狀細胞

樹突狀細胞(dendritic cells，DC)是重要的抗原遞呈細胞(antigen presenting cells, APCs)，在固有免疫和適應性免疫反應中有重要作用[36]。最近研究表明， METTL3在DC中的特異性缺失導致DC表型和功能成熟受損，表現為共刺激分子CD40、CD80和細胞因子IL-12的表達減少，并降低體外和體內刺激T細胞應答的能力[37]。在小鼠的DC細胞中特異性敲除METTL3可降低MHC-II、共刺激分子(CD80、CD86)和炎性因子(IFN-γ、IL-12)的表達水平，降低T細胞增殖激活能力，從而誘導小鼠心臟移植后的免疫耐受，并延長異體移植物存活時間[38]。以上證據表明METTL3有助于維持成熟DC表型特性。同時，Han等人報道了m6A結合蛋白YTHDF1負向調控抗腫瘤樹突狀細胞的免疫應答[39]。與野生型小鼠相比，YTHDF1缺陷小鼠表現出更高的抗原特異性CD8+T細胞抗腫瘤反應，YTHDF1-/-小鼠中PD-L1檢查點被阻斷，免疫治療效果增強，提示YTHDF1可能是抗腫瘤免疫治療的潛在靶點[39]。對于m6A調控樹突狀細胞作用研究亟待進一步深入探索。

2 m6A在腫瘤免疫中的作用

腫瘤微環境在腫瘤進展中起著重要作用并顯著影響免疫治療效果[40- 41]。近期研究表明，m6A在腫瘤免疫及腫瘤微環境的重塑過程發揮重要調控作用，其可能是重要的腫瘤免疫治療潛在靶點。

2.1 m6A在腫瘤固有免疫中的作用

固有免疫指的是機體在種系發育和進化過程中形成的天然免疫防御功能，也稱為非特異性免疫，其參與細胞主要有單核-巨噬細胞、DC細胞、粒細胞、NK細胞等。固有免疫細胞是腫瘤微環境的主要組成部分，它們在調節腫瘤的發生、生長、轉移和對治療的反應中起著復雜而多方面的作用。

前期研究表明m6A修飾在體內固有免疫反應如抵抗病毒感染等過程中發揮重要作用[42]。其不僅參與外源RNA的感知，也參與固有免疫信號轉導相關轉錄物的調控[43]。在人偏肺病毒(human metapneumovirus, HMPV)侵染的細胞中，HMPV的RNA可利用宿主細胞的甲基轉移酶發生m6A甲基化修飾，從而幫助HMPV病毒逃避固有免疫檢測及免疫攻擊[42]。宿主細胞m6A甲基轉移酶METTL3的缺失可降低SARS-CoV- 2病毒 m6A修飾，從而減少RNA病毒感受器RIG-I的識別和結合，進而增強其免疫逃逸的能力[44]。

在腫瘤微環境的固有免疫細胞中，m6A修飾可對單核-巨噬細胞、DC細胞、粒細胞、NK細胞等分化及功能產生重要調節作用，從而調控腫瘤進展。在腫瘤組織中，敲低METTL3后可以抑制由YTHDF2介導的SPRED2翻譯，從而增加由ERK介導的NF-κB and STAT3活化，并促進M1/M2樣腫瘤相關巨噬細胞向腫瘤組織的浸潤以及腫瘤的生長轉移[29]。同時，METTL3介導的m6A可促進TRAF5表達從而促進腫瘤微環境中巨噬細胞向M2 TAM轉化及結直腸癌的順鉑耐藥[45]。Song 等人[35]觀察到腫瘤微環境通過TGF-β降低METTL3表達，從而導致NK細胞的m6A水平下降，導致SHP- 2活性降低，從而導致NK細胞增殖和分化受限、效應功能受損，對腫瘤細胞反應降低。YTHDF2缺失可抑制腫瘤微環境中NK細胞的穩態及成熟，從而抑制其抗腫瘤作用，其主要機制是通過調控Tardbp從而調控NK細胞的增殖[34]。在肝癌中, Shen等人[46]分析了來自TCGA數據庫的433個肝癌樣本，發現METTL3表達與DC細胞浸潤腫瘤呈負相關。以上研究揭示m6A可調控腫瘤微環境中固有免疫細胞的分化及免疫應答從而調控腫瘤生長。

2.2 m6A在腫瘤特異性免疫中的作用

特異性免疫又稱獲得性免疫或適應性免疫，人體經后天感染或者預防接種而使機體獲得的抵抗感染能力，專門用于清除特定的病原體和建立持久的免疫記憶，包括多種細胞類型之間復雜的通信，如參與細胞免疫的T細胞及體液免疫的B細胞等。腫瘤部位的適應性免疫抗性是指腫瘤通過各種策略來適應并最終逃逸機體免疫系統攻擊，從而使得腫瘤細胞在體內生長轉移。

m6A調節適應性免疫的機制是一個新興的研究領域，近期研究表明其在腫瘤發生發展過程中起著關鍵作用。在睪丸生殖細胞腫瘤(testicular germ cell tumors, TGCTs)中，研究者發現腫瘤細胞中METTL3的異常表達影響免疫細胞的浸潤，METTL3的表達在TGCT組織中顯著下調，且其表達水平與患者生存率、腫瘤中CD8+T細胞、CD4+T細胞和NK細胞浸潤水平呈正相關，提示其可能在TGCT中發揮激活腫瘤免疫應答的作用[47]。特異性敲除METTL14會誘導CD8+T細胞沿功能障礙方向分化，破壞CD8+T細胞會影響巨噬細胞清除腫瘤的功能[15]。METTL3在結直腸癌腫瘤細胞中高表達， METTL3或METTL14的缺失增加了細胞毒性CD8+T細胞，并增加了TME中IFN-γ、CXCL9和CXCL10的分泌，從而增強了腫瘤細胞對PD-1治療的響應[48]。在宮頸癌中，METTL3在腫瘤組織中的表達遠高于癌旁組織，且其表達水平與CD33+髓系衍生抑制細胞的密度呈正相關，而CD33+髓系來源的抑制細胞的密度與患者生存率差相關[49]。乳腺癌中METTL3的表達水平與患者的生存率和腫瘤內注入的CD8+T細胞、輔助性T細胞和激活的NK細胞呈負相關[50]。在頭頸部鱗狀細胞癌中，METTL3和HNRNPC在腫瘤組織中的高表達量比正常組織高1倍，HNRNPC與CD4 naive T細胞、CD4記憶激活T細胞和嗜酸性粒細胞浸潤呈正相關[51]。 以上研究提示甲基轉移酶METTL3在T細胞介導的腫瘤特異性免疫中發揮重要調控作用。

腫瘤細胞METTL14對TME免疫細胞的影響研究處于起步階段。METTL14表達水平低預示了乳腺癌預后不良，METTL14表達水平與腫瘤中CD4+T細胞、CD8+T細胞、中性粒細胞、巨噬細胞和DC的浸潤水平呈顯著正相關，而與腫瘤中調節性T細胞的浸潤水平呈顯著負相關，提示METTL14能激活腫瘤免疫應答[52]。該研究表明，METTL14的異常表達可通過影響免疫細胞浸潤介導免疫抑制來促進腫瘤的侵襲。

3 靶向RNA m6A在腫瘤免疫治療中的作用

在腫瘤細胞中m6A及其調控蛋白表達異常從而調控腫瘤免疫微環境及腫瘤免疫應答。目前基于m6A及其調控蛋白在腫瘤免疫治療中的作用主要包括利用m6A調控蛋白特異性抑制劑提高免疫應答、誘導TME中免疫相關細胞增強免疫應答等策略。

3.1 開發m6A調節蛋白特異性抑制劑提高腫瘤免疫應答

近年來，一系列靶向m6A調控蛋白如去甲基化酶FTO、ALKBH5及甲基轉移酶METTL3的小分子抑制劑等被開發出來，其中FTO是抑制劑開發較多的靶點。在2012年至2019年期間，研究人員開發并研究了一系列FTO抑制劑，如大黃酸、甲氯芬肟酸、Radicicol、N-CDPCB、CHTB、Entacapone、2-羥基谷氨酸-酒酸(R- 2HG)、FB23、FB23- 2、CS1/CS2、Dac51等(表1)。這些FTO抑制劑在體內外均表現出顯著的抗腫瘤作用，不僅抑制腫瘤細胞增殖和腫瘤干細胞的自我更新，而且還可以抑制腫瘤干細胞的抗腫瘤免疫。如FTO小分子抑制劑Dac51與PD-L1單抗聯用顯著抑制了小鼠黑色素瘤細胞、肺癌細胞以及結腸癌細胞的成瘤性，且腫瘤完全消失的小鼠激發免疫記憶細胞應答，可抵抗10倍移植數量的小鼠結腸癌細胞的再次成瘤。其能夠抑制腫瘤細胞的糖代謝途徑，進而增強腫瘤浸潤免疫T細胞的抗腫瘤功能，具有潛在的臨床應用價值[53]。

表1 m6A 甲基化酶抑制劑

2021年，英國劍橋大學、英國Storm Therapeutics公司等開發在體內具有活性的m6A甲基化酶METTL3小分子抑制劑——STM2457，并進一步證實該抑制劑能夠有效抑制急性髓系白血病發展[54]。鑒于METTL3在T細胞及多種免疫細胞中的發揮重要調控作用，其小分子抑制劑在腫瘤免疫應答中的作用亟待深入研究。

3.2 TAM是腫瘤免疫治療的重要潛在靶點

TAMs是腫瘤微環境中促腫瘤作用中的關鍵成分，可在腫瘤起始、生長、血管生成、淋巴管生成、局部和遠處轉移發揮重要促進作用[65]。 通過將腫瘤M2巨噬細胞轉化為抗腫瘤M1樣表型是重要的潛在抗腫瘤治療方式[27]。前期研究抑制絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶 1可以將TAMs 重編程為 MHCIIhiTNFα+IFNγ+STAT1 依賴的免疫原性表型從而獲得抗腫瘤效應[66]。前期研究提示干擾巨噬細胞的METTL3可增強重塑腫瘤微環境中M1樣和M2樣TAMs的浸潤并降低PD-1的治療響應程度顯著降低[29]，因此活化細胞內m6A相關調控蛋白可能是提高免疫應答的有效策略。

4 總結與展望

隨著研究的深入, m6A甲基化修飾及其調控相關蛋白的作用和生物學意義以及在惡性腫瘤中的調控機制均得到了較為深入的研究。研究發現m6A修飾可調節免疫細胞的激活和進入腫瘤微環境，從而影響免疫治療的效果。因此，m6A修飾可能是腫瘤免疫治療的重要潛在靶點。在接下來的研究中，針對m6A修飾開發腫瘤免疫治療相關策略方向有：針對m6A調節劑的特異性高效抑制劑與免疫檢查點阻滯劑相結合，開發有效的免疫治療途徑；開發針對單基因或者多基因m6A基因編輯系統，可用于增強T細胞或自然殺傷細胞的抗腫瘤免疫應答；深入闡析不同調控蛋白在腫瘤免疫微環境各類細胞分化及免疫應答階段的特點，做到更為精準的腫瘤免疫調控及干預。

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