非洲豬瘟病原學特征及其疫苗的研究進展

劉小琬，許 輝，王 寒，岳雙明，周遠成

（1.四川水利職業(yè)技術學院，四川 成都 611200；2.四川省畜牧科學研究院畜禽生物制品四川省重點實驗室，四川 成都610066，3.畜科生物工程有限公司四川省動物生物制品工程技術研究中心，四川 成都 610200）

ASFV 感染以肺水腫、發(fā)燒、皮膚發(fā)紺、網狀內皮系統(tǒng)出血為主要特征，死亡率高達100%，嚴重危害養(yǎng)豬業(yè)，世界動物衛(wèi)生組織（OIE）將其列為法定上報動物疫病之一，是我國一類動物疫病［1］。非洲豬瘟的傳播史已逾一個世紀，1921年非洲東部肯尼亞最早報道ASF，20世紀50年代傳入歐洲、葡萄牙、西班牙等國，開始了在西歐的流行［2］。20世紀70年代傳入巴西等歐美地區(qū)，2007年ASFV叩響了亞洲的大門，俄羅斯、格魯吉亞相繼暴發(fā)疫情。我國于2018 年8 月在沈陽首次報道ASFV，截至2022 年7 月，我國已累計報道192起，撲殺生豬共計120多萬頭，目前沒有再出現區(qū)域性暴發(fā)流行。疫情暴發(fā)初期，我國生豬養(yǎng)殖存欄量急劇下降，豬肉曾一度供不應求，從而導致生豬和豬肉產品價格上漲幅度過大［4］。盡管全世界對ASFV 疫苗研究已有幾十年，但還沒有一個疫苗批準上市，因此，了解ASFV主要保護性抗原結構及其疫苗的研究進展，對于防控ASF疫情具有十分重要的意義。

1 非洲豬瘟病毒的病原學特征

1.1 結構特點 ASFV是非洲豬瘟病毒科非洲豬瘟病毒屬的唯一成員，也是目前已知的唯一蟲媒大型DNA 囊膜病毒。病毒粒子呈正二十面體對稱結構，直徑約200 nm，長度為170～190 kb，有160～175個開放閱讀框（ORFs），可編碼150～200 種蛋白質，包括多種結構蛋白及參與DNA復制、修復、轉錄的酶和因子等，其表達受時間調控。

1.2 ASFV 的病毒蛋白 ASFV 的開放閱讀框可編碼病毒不同抗原表位，其中結構蛋白有pp220、p30、p54、p72、A104R 和CD2v 等，非結構蛋白有F334L、K196R 和NP419L，未知功能蛋白有B602L、C44L、Cp312R和K205R。其中p54、K205R、A104R 和B602L 這4 種蛋白產生的抗體具有更強、更持久的抗體滴度。ASFV 可在主動脈內皮細胞及巨噬細胞中復制，通過胞吞作用進入細胞，前期有試驗研究表明，p30、p54、pp62、p72 及CD2v蛋白有助于病毒的快速吸附和入侵。

p30 蛋白是ASFV 重要的結構蛋白，由CP204L 基因所編碼，相對分子量為30 ku，是ASFV 早期表達的內膜蛋白，在感染早期可檢測到表達，并持續(xù)存在于整個感染周期。因其有較強的抗原性和免疫原性，可刺激機體產生特異性抗體，常用于血清學診斷。周改靜等［4］利用原核表達p30蛋白建立了阻斷ELISA檢測方法，對208份血清樣品進行檢測，結果與Ingenasa 公司試劑盒檢測的結果一致。

p54 蛋白是由E183L 編碼的ASFV 的另一個結構蛋白，分子量約為25 ku，在其N 端附近有一個潛在的跨膜區(qū)域和Gly-Gly-X 氨基酸序列，對病毒形態(tài)的形成非常重要，對包膜前體聚集及病毒粒子組裝轉運有很重要的作用。p54蛋白誘導產生的抗體能夠抑制ASFV 附著到易感細胞中，感染后最早一個星期就能檢測，并能在血液中持續(xù)數周，也常被應用于ASFV的血清學診斷中。

p72 蛋白是病毒二十面體衣殼的主要成分，由B646L基因編碼，分子量大小約為73.2 kDa，抗原性及免疫原性強而穩(wěn)定，產生的抗體可阻斷ASFV與巨噬細胞的結合。在病毒感染末期能檢測到p72 蛋白表達，它與病毒的吸附、入侵有關，p72 的表達是病毒復制的標志，廣泛應用于病毒檢測方法的建立。周遠成等［5］利用真核表達載體及輔助蛋白B602L 基因協(xié)同表達p72 蛋白，重組腺病毒感染細胞后可以同步表達非洲豬瘟p72、B602L蛋白，將該重組腺病毒接種實驗動物，可刺激實驗動物產生特異性抗體，為今后建立特異性強、穩(wěn)定性好和結合能力高的ASFV 血清學診斷方法奠定了良好的基礎。

CD2v 蛋白是由EP402R 基因編碼，具有跨膜結構的糖蛋白，類似于T 淋巴細胞表面的黏附受體CD2，是唯一已知的細胞CD2 的同源物，主要參與細胞間的黏附、毒性增強以及免疫應答調節(jié)過程，與ASFV的組織趨向性、免疫逃避機制等密切相關，在ASFV 感染的發(fā)病機制中可能有一定的作用，屬于晚期表達蛋白。CD2v蛋白可破壞淋巴細胞功能，影響機體對病毒感染后的清除，并阻礙機體產生免疫保護作用。

1.3 傳播途徑 ASF在一個世紀前就已出現，在全球經濟一體化的趨勢下，已導致全球60多個國家流行。ASFV 是一類可經蟲媒傳播的病毒，在軟蜱中可存活數月至數年，帶毒的軟蜱通過叮咬家豬使病毒得以擴散，可感染家豬和野豬。發(fā)病動物的分泌物、排泄物、組織及被污染的飼料、飲水、泔水、車輛等也可傳播病毒，可經由呼吸道、消化道、肌肉等多種途徑感染豬群。我國ASF的暴發(fā)，主要是由于生豬調運頻繁、散養(yǎng)戶過多、基層生物防控意識薄弱及感染豬只副產品的大范圍運輸導致的。

1.4 臨床表現 ASFV感染豬只后會在淋巴結中大量繁殖，擴散后形成病毒血癥，并在肺臟、腎臟、腸道等器官中進一步復制，從而引起嚴重的病理損傷，導致血管通透性增加，引起臟器嚴重出血。尤其是高毒力株感染后，最急性ASF的癥狀表現為病豬發(fā)熱，成堆擁擠在一起，往往無明顯癥狀就突然倒地死亡；急性ASF的臨床癥狀表現為高熱稽留，共濟失調，四肢發(fā)紺，多臟器出血，充血性脾腫大，肺臟水腫，淋巴細胞減少癥和血小板減少癥等［6］。低毒力株一般病死率低，臨床癥狀不明顯，呈持續(xù)性感染，表現為妊娠母豬流產，逐漸消瘦、跛行，關節(jié)腫大和皮膚潰瘍等，并會長期排毒［7］。

1.5 致病機制 ASFV 主要侵襲宿主的單核-巨噬細胞，感染過程非常復雜，影響因素眾多，還依賴多個細胞因子［8］。前期研究證實，ASFV進入細胞的內吞途徑主要由網格蛋白介導和發(fā)動蛋白介導。除此之外，ASFV 也能通過大胞飲的方式進入細胞，這主要是依賴細胞膜局部的不穩(wěn)定性來實現［9］。ASFV 進入細胞后，ASFV 顆粒從早期的內吞體移動到晚期的內吞體，并依賴內吞體內的酸性環(huán)境完成脫殼。ASFV感染會導致細胞內膽固醇向“病毒工廠”富集，這可能對ASFV 的膜融合和病毒復制起到至關重要的作用。ASFV病毒粒子的組裝涉及依賴微管的波形蛋白的重排，病毒粒子成熟后，依靠微管蛋白轉運到細胞膜，并通過出芽方式從細胞中釋放［10］。

2 非洲豬瘟疫苗的研究進展

ASF 流行100 多年，目前還沒有一種成熟的疫苗可以防控，因該病毒具有強大而復雜的免疫逃逸機制，主要保護性抗原尚未完全明確，病毒基因型多且易變異，所以關于ASF疫苗使用的爭議從未間斷，尤其是在疫苗研發(fā)評估、臨床應用方面需謹慎。即便道路坎坷，學者們仍在為ASFV疫苗的研制不斷努力，并取得一定的成效，目前主要研究的是滅活疫苗、減毒活疫苗、亞單位疫苗。

2.1 滅活疫苗 滅活疫苗是目前技術已經很成熟的一種傳統(tǒng)疫苗研制方法，通過細胞培養(yǎng)出大量的病毒，經過一系列化學或物理方式使病毒喪失致病性，同時保持病毒抗原顆粒的完整性，從而刺激機體產生保護性抗體。關于ASFV滅活疫苗的最新研究是在2014年進行的，用新型現代佐劑對其進行了安全性測試，但是這些方法并沒有讓接種豬群得到有效保護。Estefania等［11］在低溫下用低濃度的二乙烯亞胺（BEI）滅活病毒，聯合新的強效佐劑，通過皮內、肌內同時雙重接種，4周后用相同劑量和注射方式進行增強免疫，接種6 周后肌肉注射強毒株攻毒，結果所有動物均有ASF的臨床癥狀和病理表現，說明采用滅活疫苗沒有對ASFV攻擊產生有效保護。ASF滅活疫苗采用了各種新型的保護佐劑，迄今為止研究結果顯示ASF滅活疫苗無法提供有效保護，可能是由于病毒表面蛋白差異性很大，不是所有的抗原在失活后還保留完整結構，因此影響了免疫效果，也表明細胞免疫在預防ASFV 中的重要性。而要產生細胞反應，宿主細胞中必然有大量的病毒復制，這為減毒活疫苗的有效性提供了理論基礎。

2.2 減毒活疫苗

2.2.1 傳統(tǒng)減毒活疫苗 減毒活疫苗毒性明顯減少，既保持了原有的抗原性，又誘導體內產生強烈持久的免疫應答，但因其存在毒力返強及病毒變異的問題，極大地限制了該類疫苗的應用。葡萄牙在1962 年啟動了非洲豬瘟弱毒疫苗田間試驗，結果出現母豬流產、皮膚壞死、關節(jié)炎、肺部損傷等慢性感染現象［12-13］。利用從軟蜱或者慢性感染豬只體內分離到的天然弱毒株（OURT88/3和NH/P68）而制備的減毒活疫苗（LAV），在接種豬只后可以對同源毒株產生很好的免疫保護，不同的免疫途徑、接種劑量、攻毒株會產生不同的保護率［14］。通過非敏感細胞Vero細胞連續(xù)傳110代致弱的LAV，在免疫豬群后，其體內復制能力降低，毒力逐步喪失，毒力基因的表達能力明顯下降，不能抵抗親本毒株的攻擊，也就不能提供有效的保護。

2.2.2 基因工程減毒活疫苗 ASF減毒活疫苗具有毒株特異性，傳統(tǒng)天然弱毒及人工培養(yǎng)弱化制備的LAV，其免疫效果差異巨大，包括殘余毒力、病毒血癥和亞臨床癥狀等，因此越來越多的學者開始研究基因缺失弱毒苗，認為其安全性及可靠性更高。張艷艷等［15］以SY18 為親本株構建了ASFV MGF 和CD2v 基因缺失疫苗候選株，并對其安全性和免疫保護效果進行了特性研究，結果顯示，該雙基因缺失株能夠抵抗親本強毒株SY18株的攻擊。Elisabeth 等［16］用Ba71 ASFV 毒株基因缺失苗（缺失CD2基因）免疫豬只，能激活免疫系統(tǒng)并產生較強的抗體水平，有效抵抗親本毒株Ba71 和異源E75 毒株（兩種基因型Ⅰ株）的致命攻擊。這些結果為將來研發(fā)ASFV交叉保護疫苗開辟了新途徑，表明基于CD2v 的減毒活疫苗具有較大的開發(fā)前景，這對于在病毒流行和多種毒株傳播地區(qū)的ASFV 防控至關重要。目前ASFV重組致弱活疫苗主要集中于敲除TK、9GL、UK、EP402R、NL、MCF 360/55 基因，可以讓病毒毒力減弱且兼具較好的免疫原性。備受關注的哈獸研的非洲豬瘟7 基因缺失減毒活疫苗（ASFV-7GD）已開展相關臨床試驗，若能通過安全性和免疫原性檢測，同時找到穩(wěn)定的生產細胞系，有可能成為首個商品化ASF疫苗。

2.3 亞單位疫苗 傳統(tǒng)亞單位疫苗是將可控蛋白質分解或水解后純化，進而篩選出具有免疫活性的小分子片段制備成疫苗。因沒有病毒核酸，克服了傳統(tǒng)減毒活疫苗滅活不完全、毒力返強等問題，安全性更好，但保護效力相對較弱。利用桿狀病毒、牛痘病毒、腺病毒、新城疫病毒、偽狂犬病毒作為病毒載體，能刺激細胞免疫，提供更優(yōu)秀的免疫保護效率，布局該技術路徑的包括普萊柯生物股份、中牧股份等企業(yè)。ASFV的CD2v 不是強免疫原性抗原，因此需接種較大劑量的蛋白質才能誘導產生較高的抗體水平。用桿狀病毒表達的p54/p30 融合蛋白免疫豬群，可以產生一定量的中和抗體，并在攻毒后改善病程，減少病毒血癥的發(fā)生，同時保護豬只免受E75 的致命攻擊。利用桿狀病毒來表達的CD2v/p54/p30 蛋白，在免疫豬群后能產生中和抗體抵抗強毒株的攻擊，但會出現不同程度的病毒血癥。ASFV 基因組結構龐大復雜，編碼蛋白多且容易發(fā)生變異，是影響疫苗研發(fā)和免疫效果的重要因素之一。p72 蛋白在體外單獨表達時容易出現錯誤折疊，用輔助蛋白B602L 共表達時可得到正確折疊構象的p72 蛋白［17］。將表達ASFV B646L、EP153R、EP402R 的抗原重組痘苗病毒免疫豬只后，能夠誘導IFN-γ分泌和T淋巴細胞增殖分化，但不能誘導機體體液免疫應答［18］。

3 展望

伴隨經濟全球化發(fā)展，跨地域的人員和貿易流通加快，養(yǎng)殖密度不斷提高，養(yǎng)殖模式越來越多樣化等，給ASF 的防控帶來更加嚴峻的挑戰(zhàn)，而ASF疫苗的研究歷來是一個世界性難題，盡管各國科學家們進行了各種不同的嘗試，但由于其基因組結構復雜，免疫逃避機制尚未研究透徹，至今仍無商業(yè)化的疫苗上市，給世界養(yǎng)豬業(yè)帶來了嚴重的損失和威脅。隨著生物學技術的不斷發(fā)展，以及對ASFV發(fā)病機制、免疫逃逸機制等的深入研究，相信在不久的將來，安全、可控的ASF疫苗定會成功問世。