GmNTLs 調控大豆根系響應低磷脅迫的功能研究

李雅雪 盤耀亮 彭光粉 田江 陸星 梁翠月

摘要： 【目的】低磷和鋁毒脅迫是酸性土壤中限制作物生產的重要因素。植物NTL 轉錄因子參與調控多種環境脅迫（包括鋁毒脅迫） 的適應性機制，本文探究GmNTLs 調控大豆Glycine max 根系響應低磷脅迫的功能。【方法】通過RT-qPCR 分析大豆15 個GmNTLs 基因在根系響應低磷脅迫的表達模式，進一步構建了GmNTL1/4/7/8/10/12 共6 個GmNTLs 基因的擬南芥超量表達材料，探究GmNTL 成員在擬南芥根系中響應低磷脅迫的功能?！窘Y果】系統進化樹及組織表達模式分析結果表明，GmNTLs 家族分3 個亞族，各亞族成員在大豆中組織表達模式不同。RT-qPCR 結果表明，低磷處理12 d 顯著提高了GmNTL1/4/7/8/10/12 在大豆根系中的表達。在擬南芥中超量表達不同GmNTL 基因對低磷的響應不同。高磷處理下，超量表達GmNTL4/10/12 擬南芥的鮮質量顯著增加；低磷處理時，超量表達GmNTL4顯著提高擬南芥鮮質量，而超量表達GmNTL1/12 擬南芥的鮮質量顯著降低。同時，僅超量表達GmNTL12擬南芥的主根長顯著縮短，而超量表達其他基因對擬南芥植株的主根長無明顯影響?！窘Y論】GmNTLs 參與大豆根系對低磷脅迫的響應，該結果可為培育磷高效型大豆品種提供數據支持。

關鍵詞： 大豆；根系；低磷脅迫；GmNTLs；NTL 轉錄因子

中圖分類號： Q945.78；S529文獻標志碼： A 文章編號： 1001-411X（2023）02-0221-09

NAC（NAM、ATAF1/2、CUC2） 是與植物生長發育和脅迫相關的特異性轉錄因子[1]。NTL（NACwith transmembrane motif like） 則是蛋白C 端帶有跨膜結構域的一類NAC 轉錄因子[ 2 ]。研究顯示，NTL 家族成員在調控生物、非生物脅迫應答和植物發育過程中發揮重要作用[3]。目前多個NTL 的功能被報道，例如，超量表達擬南芥ANAC017/AtNTL7增強了轉基因植株對內質網脅迫的耐受性[4]；在擬南芥中超量表達ANAC005 抑制了與木質素、形成層、初生壁等生物合成相關的基因的表達，造成植株矮化[ 5 ]；在擬南芥中異源表達玉米ZmNTL1、ZmNTL2 和ZmNTL5，可以降低轉基因擬南芥對H2O2 的敏感性[6]；超量表達AtNTL6 增強轉基因擬南芥植株的抗旱能力[7]；AtNTL8 在鹽脅迫下調控赤霉素（GA） 途徑促使種子萌發，同時調控擬南芥的開花時間[8]；AtNTL6 受冷脅迫，誘導PR1、PR2 和PR5 等相關抗病基因的表達[9]。

我國南方地區土壤多呈酸性。低磷和鋁毒是酸性土壤中長期共存的營養逆境因子，植物為了適應酸性土壤的缺磷和鋁毒脅迫，進化出各種協同調控和應答機制，如分泌有機酸、改變根系形態構型等[10-14]。大豆Glycine max 是重要的糧油兼用作物，我國大豆產量不足以滿足國內需求，需依賴進口[15]。南方酸性土壤中存在低磷、鋁毒脅迫從而限制了大豆的生產[ 1 6 ]。在大豆基因組中鑒定到1 5 個GmNTL 同源基因并對其進行了功能分析，結果表明，超量表達GmNTL1、GmNTL7 等顯著提高轉基因擬南芥對鹽害和干旱的耐受能力[17-19]。前期研究結果表明，GmNTLs 參與了大豆耐鋁毒脅迫，超量表達GmNTL4 可能通過調控外排有機酸或細胞壁修飾相關基因來提高轉基因擬南芥對鋁的耐受性[ 2 0 ]。進一步比較分析野生型（WT） 和超量表達GmNTL4 轉基因擬南芥根系的轉錄組數據，發現一些與根系生長相關的基因，包括RGF2、Extensin、Auxin-responsive protein 等，均受GmNTL4 調控，而一些磷平衡相關基因，包括紫色酸性磷酸酶基因P A P 2 0 （ A t 3 g 5 2 7 8 0 ）、酸性磷酸酶基因V S P 1（At5g24780） 和VSP2 （At5g24770） 等，也受GmNTL4調控，但未發現磷轉運子相關基因受GmNTL4 調控[20]。據此，我們猜測GmNTLs 可能參與了大豆生長對低磷的適應性機制。因此，本研究首先對大豆基因組中15 個GmNTL 成員進行系統進化樹和組織部位表達模式分析，然后利用RT-qPCR 測定該家族成員響應低磷脅迫的表達模式，進一步構建GmNTLs 超量表達轉基因擬南芥株系，對其鮮質量和總根長進行分析。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗采用的大豆材料為磷高效品種‘粵春03-3（YC03-3）；擬南芥材料為哥倫比亞野生型（Col-0）。1.2 大豆GmNTLs 基因家族進化及表達模式預測分析在Phytozome 網站（https：//phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html） 利用BLAST 搜索引擎查找G m N T L s 家族氨基酸序列。使用軟件M E G A 7（http：//http//www.mega software.net） 以鄰接法構建進化樹。利用S o y B a s e 數據庫（ h t t p s ： / / w w w .soybase.org/soyseq/） 獲得大豆GmNTLs 家族基因的組織表達數據。

1.3 大豆不同磷濃度處理

大豆磷處理試驗在華南農業大學根系生物學研究中心的溫室大棚中進行。用砂培萌發種子3～4 d，挑選長勢均一的大豆幼苗轉移至Hoagland 營養液中進行磷處理：250 μmol·L?1 KH2PO4（高磷） 和5 μmol·L?1 KH2PO4（低磷）。每個處理4 次重復，每次重復4 株苗。收取處理6、12 d 的大豆生理樣品，測量主根長，稱取鮮質量，同時收取根系樣品用液氮速凍后保存在?80 ℃ 冰箱備用。設置5、50 和250 μmol·L?1 KH2PO4 3 個磷濃度，處理12 d，分析不同磷濃度下大豆G m N T L s 家族基因的表達模式。

1.4 植物RNA 的提取、反轉錄及RT-qPCR

用TRIzol（Omega，美國） 法提取大豆根系RNA；使用HiScript?1st Strand cDNA SynthesisKit 反轉錄試劑盒（Promega，北京），將其反轉錄為cDNA 單鏈。在NCBI 網站（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/） 設計GmNTLs 基因及大豆看家基因GmEF1a 的定量PCR 引物（GmNTL1 的正向引物為GTCGTCGAGTGTTACCCACA，反向引物為CGTAGCTCGGTTCAACCTGT；GmNTL4 的正向引物為GCCGTTAGGGTTCCGTTTC，反向引物為GCTCCTTCAAAGTGGGACGATA；GmNTL7 的正向引物為CCCAAGTGCATCAGAAGGCT，反向引物為GCAGTGTCTTTACCTGCTGC；GmNTL8 的正向引物為CAATATGTGCGGAGGAAG，反向引物為G T G A T G A T G A G T A G T T G G A T T ；G m N T L 1 0 的正向引物為T T C T G C C C T A CCGATGAGGA，反向引物為TTTCGCTCTTTGC C A G T T G C ； G m N T L 1 2 的正向引物為CATGGATATTTGCTCACCCTGC，反向引物為AGGCTTGTGCCATTTTCAGC；GmEF1a 的正向引物為TGCAAAGGAGGCTGCTAACT，反向引物為CAGCATCACCGTTCTTCAAA），用實時熒光定量PCR 儀（Thermo Fisher，美國） 測定，相對表達量為目的基因表達量與看家基因表達量的比值。

1.5 大豆GmNTLs 家族基因克隆及重組載體構建

從Phytozome 數據庫中獲得大豆GmNTLs 家族中GmNTL1、GmNTL4、GmNTL7、GmNTL8、GmNTL10 和GmNTL12 基因的C DS 序列，在NCBI 網站設計其正反向引物，按照一步克隆法連接華南農業大學根系生物學研究中心保存的3 5 S ： p T F 1 0 1S 載體。測序正確后，利用試劑盒Hipure Fungal DNA Mini Kit （Magen，廣州） 抽取質粒，保存備用。

1.6 超量表達GmNTLs 轉基因擬南芥的轉化與篩選

將“1.5”獲取的6 個GmNTLs 重組載體轉化農桿菌GV3101（唯地，上海），使用花序侵染法進行擬南芥轉化。獲得T0 代擬南芥轉基因種子后，取種子用5% （φ） 次氯酸鈉溶液進行表面消毒，均勻種植在含0.025% （φ） 除草劑的擬南芥MS 固體萌發培養基中，放置在培養條件為日長12 h、光照4 000 lx、溫度23 ℃、相對濕度75%，黑暗12 h、溫度21 ℃、相對濕度75% 的人工氣候箱（萊福儀器，寧波） 中生長14 d 左右。將正常存活且長出4 片葉子的T1 代存活幼苗移植到蛭石、基質質量比為1∶3 的混合基質中，在12 h 光照/12 h 黑暗條件下生長，待植株葉片較大時取樣進行PCR 檢測來篩選陽性轉基因株系。分株收取陽性T1 代種子重復上述的篩選步驟，獲得存活幼苗為T2 代，選取T2 代種子于平板篩選陽性和陰性植株分離比為3∶1 的株系進行T3 代純合體的篩選。

1.7 轉基因擬南芥低磷脅迫處理

將T3 代轉基因植株種子和野生型擬南芥種子消毒后播種在MS 固體萌發培養基上，待根長至1 cm左右，挑選長勢一致的幼苗移至1 250 μmol·L? 1KH2PO4 的高磷處理、12.5 μmol·L?1 KH2PO4 的低磷處理MS 培養基上，在“1.6”人工氣候箱中處理12 d，收樣，測定植株鮮質量和主根長。

1.8 數據統計及分析

所有試驗數據通過M i c r o s o f t E x c e l2019（Microsoft，美國） 和IBM SPSS StatisticsV26.0（IBM SPSS，美國） 進行處理及統計分析。用TBtools 軟件（http：//www.tbtools.com/） 繪制表達模式熱圖。

2 結果與分析

2.1 GmNTLs 蛋白家族進化樹及組織表達模式分析

對15 個GmNTLs 家族構建系統進化樹，結果顯示，GmNTLs 家族分為I、II 和III 3 個亞家族，7 個復制對。其中GmNTL2/12 和GmNTL8/13 2 個復制對屬于第I 亞族；GmNTL6/15 和GmNTL7/142 個復制對屬于第I I 亞族， G m N T L 1 / 1 1 、G m N T L 3 / 4 和G m N T L 9 / 1 0 3 個復制對及GmNTL5 屬于第III 亞族（圖1）。

利用SoyBase 數據庫對GmNTLs 基因在不同組織部位的表達水平構建表達模式熱圖，（其中GmNTL5、GmNTL6 和GmNTL9 這3 個基因未被收錄），結果如圖1 所示。第I 亞家族成員在各組織部位中幾乎不表達。第I I 亞族中G m N T L 7 和G m N T L 1 4 在各組織部位表達量都很低；GmNTL15 主要在根和根瘤中表達。第III 亞族中GmNTL1 在根中有較低表達量；GmNTL3 在新葉、根瘤、花后14 d 的莢中表達量較高；GmNTL4 主要在根瘤和花后14 d 的莢中表達，其中在根瘤中的表達量最高。

2.2 不同磷處理時間對大豆生長及GmNTLs 基因家族表達模式的調控

使用水培體系對大豆YC03-3 幼苗進行高磷（ 2 5 0 μ m o l · L ? 1 K H 2 P O 4 ） 和低磷（ 5 μ m o l · L ? 1KH2PO4） 處理6、12 d 后分別收樣。結果顯示，高、低磷處理6、12 d 后，高磷處理大豆的地上部生物量要明顯高于低磷處理的；而低磷處理大豆的根系要比高磷處理的發達（圖2、3）。具體表現為，處理6、12 d 后，與高磷處理相比，低磷處理的地上部干質量顯著減少3.6% 和43%（圖3A）；同時，處理12 d后，低磷處理的根系干質量和總長度分別顯著增加5.5% 和39%（圖3B、3C）。以上結果表明，低磷處理顯著促進大豆根系的生長，植物可以通過根系生長的變化來適應低磷脅迫。

根據系統進化樹結果，從GmNTLs 家族的6 個復制對中各挑取1 個基因包括G m N T L 1 、G m N T L 4 、G m N T L 7 、G m N T L 8 、G m N T L 1 0 和GmNTL12，分析不同磷有效性和磷處理時間對大豆GmNTLs 在根系表達水平的影響。結果顯示，GmNTLs 家族基因的表達量均在6 或12 d 受低磷脅迫誘導顯著上調（圖4）。在磷處理6 d 后，低磷條件下， G m N T L 1 、G m N T L 4 、G m N T L 8 和GmNTL12 的表達水平分別比高磷的高1.8、1.8、2.1 和2.1 倍（圖4A、4B、4D、4F），GmNTL7/10 與高磷條件下無明顯差異（圖4C、4E）。磷處理12 d 后，低磷條件下G m N T L 1 、G m N T L 4 、G m N T L 7 、GmNTL8、GmNTL10 和GmNTL12 的表達水平分別比高磷條件下高3.5、5.5、1.5、3.5、1.9 和3.2 倍（圖4），這些結果表明GmNTLs 參與了大豆根系適應低磷脅迫過程。

2.3 不同磷處理濃度對大豆根系中GmNTLs 表達模式的影響

從“2.2”結果可知，當磷處理12 d 后，大豆根系中GmNTLs 的表達模式受低磷誘導上調較為顯著，因此進一步探究了不同磷濃度（5、50 和250μmol·L?1 KH2PO4） 處理12 d 對大豆根系GmNTLs表達模式的影響。結果表明：隨著磷處理濃度的降低，GmNTLs 基因的表達量整體顯著上調（圖5）。當磷濃度從250 μmol·L?1 下降到50 μmol·L?1 時，除GmNTL10 基因的表達量無明顯變化外，其他基因的表達量均隨磷濃度降低而顯著上調，上調比例介于22.1%～142.6%；而當磷濃度從50 μmol·L?1 進一步下降到5 μmol·L?1 時，6 個GmNTLs 的表達量均顯著上調，上調比例介于20.3%～129.7%。以上結果進一步表明GmNTLs 基因參與了大豆根系響應低磷脅迫的過程，但各成員響應程度有差異。

2.4 低磷脅迫對超量表達GmNTLs 擬南芥生長的影響

野生型和超量表達GmNTLs 的轉基因擬南芥幼苗在高、低磷MS 固體培養基處理12 d 后，分析植株鮮質量和主根長。結果（圖6、7、8） 顯示，與野生型（WT） 相比，高磷條件下，超量表達GmNTL4、GmNTL10 和GmNTL12 促進了擬南芥植株的生長，其鮮質量分別顯著增加11.0%、12.4%， 13.0%、14.4% 和22.2%、16.2%（圖7B、7E、7F）；低磷條件下，超量表達GmNTL4 擬南芥鮮質量顯著增加8.3%、15.9%（圖7B），而超量表達GmNTL1 和GmNTL12 擬南芥鮮質量顯著減少11.4%、13.3%和17.8%、17.5%（圖7A、7F）。與鮮質量相似，在高磷條件下，超量表達GmNTL4 和GmNTL12 植株的主根長顯著增加4.7%、3.8% 和7.0%（圖8B、8F）；在低磷條件下，超量表達GmNTL12 植株的主根長顯著減少7 . 7 % 、6 . 8 % （ 圖8 F ） 。超量表達GmNTL7 和GmNTL8 基因對轉基因擬南芥的生長無明顯影響（圖7C、7D、8C、8D）。結果表明不同GmNTL 基因成員對擬南芥響應低磷脅迫的功能不同。

3 討論與結論

植物NTL 轉錄因子參與干旱、鹽害、滲透和鋁毒等非生物脅迫[7， 18-23]。酸性土壤中鋁毒和低磷脅迫共同存在，植物進化出一系列協同調控應答機制[10-14]，Lin 等[20] 研究表明，GmNTLs 參與了大豆耐鋁毒脅迫，但是否調控大豆根系響應低磷脅迫還未見報道。本研究通過設置不同磷濃度和不同脅迫時間處理，解析低磷脅迫對GmNTLs 基因在大豆根系中表達水平的調控模式，發現GmNTLs 基因成員都不同程度地受到低磷誘導上調表達，暗示這些GmNTLs基因均在大豆響應低磷脅迫中發揮作用；進一步分析發現，不同基因成員響應模式有所區別，其中GmNTL1、GmNTL4、GmNTL8 和GmNTL12 基因的表達量在低磷處理6、12 d 后顯著大幅度上調，而GmNTL7 和GmNTL10 基因的表達量在低磷處理6 d 時無明顯變化，只在12 d 后顯著上調。不同磷濃度處理的結果也類似，GmNTL10 基因的表達量只在極度缺乏磷時顯著上調表達，而其他基因表達量隨磷濃度減少不斷顯著增加，暗示這些GmNTLs基因在大豆適應低磷脅迫中可能起重要的作用。

為進一步驗證GmNTLs 在大豆根系響應低磷脅迫中的功能，本研究通過擬南芥的異源表達，構建了超量表達GmNTL1/4/7/8/10/12 6 個基因的擬南芥轉基因材料；結果顯示，不同GmNTL 基因成員在擬南芥響應低磷脅迫中的功能不同。超量表達GmNTL4 和GmNTL12 基因后，擬南芥轉基因株系的鮮質量和主根長與野生型差異顯著。例如，高磷條件下，超量表達GmNTL4 的轉基因擬南芥鮮質量和主根長均顯著高于野生型，但低磷條件下其主根長無明顯變化，說明GmNTL4 可能參與了植株地上部生長對磷供應的適應性的調控，但對根系的調控作用不明顯。另外， 低磷條件下， 超量表達GmNTL12 的轉基因擬南芥鮮質量和主根長均顯著低于野生型，而高磷條件下，超量表達GmNTL12 的轉基因擬南芥表型與低磷相反。主根縮短是擬南芥根系響應低磷脅迫的重要反應之一[24]，低磷誘導的擬南芥主根生長是由生長素信號途徑因子TIR1、A U X / I A A 、A t A R F 1 9，以及STOP1、LPR1 和P D R 2 等多基因調控的綜合結果[ 2 5 - 2 8 ] 。關于GmNTL12 為什么在不同磷處理下對根系生長的影響不同，其調控機理還有待進一步研究。與GmNTL4相反，超量表達GmNTL1 和GmNTL12 顯著降低了轉基因株系在低磷條件下的鮮質量，暗示GmNTL1和GmNTL12 可能參與植物適應低磷脅迫的負調控。無論是在高磷還是低磷條件下，超量表達GmNTL7和GmNTL8 基因，對轉基因擬南芥的鮮質量和主根伸長均無明顯影響。當植物處于逆境時，膜結合轉錄因子轉運到細胞核后發揮功能[29]。超量表達NTLs全長的轉基因幼苗與對照之間通常不存在表型差異，但是當去除過表達基因跨膜域后，表型出現明顯差異[21， 30]；推測超量表達GmNTL7 和GmNTL8 轉基因擬南芥在受到低磷脅迫時，可能沒有誘導膜釋放或膜釋放不當，導致這2 個轉基因擬南芥與野生型無表型差異。

綜上所述，低磷脅迫上調了大豆根系中GmNTL1/4/7/8/10/12 基因的表達，GmNTLs 參與了大豆根系對低磷脅迫的響應。本研究結果可為后續深入研究NTL 在大豆生長發育過程中的功能提供理論依據。

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【責任編輯 李慶玲】