丁酸梭菌芽孢對凡納濱對蝦生長性能、血清生化指標、腸道菌群及短鏈脂肪酸含量的影響

袁海林 李向策 孫秋璇 譚小紅 蘇友祿 黃燕華 尹文飛 周萌

摘要： 【目的】研究飼用丁酸梭菌Clostridium butyricum （CB） 芽孢對凡納濱對蝦幼蝦生長性能、血清生化指標、腸道菌群組成及5 種短鏈脂肪酸含量的影響?！痉椒ā糠謩e將質量分數為0（對照）、0.050%、0.075% 和0.100% 的丁酸梭菌芽孢制劑添加到基礎飼料中（飼料中的活菌數分別為0、2.50×105、3.75×105、5.00×105 CFU/g），飼喂初始體質量為（1.42±0.02） g 的凡納濱對蝦幼蝦30 d，然后檢測生長性能、血清生化指標、腸道菌群組成以及短鏈脂肪酸含量?！窘Y果】與對照組相比，飼喂30 d 后對蝦的體質量在0.050% 和0.075% CB 組顯著提高（P<0.05），質量增加率則在0.050% CB 組顯著提高（P<0.05）；0.075% CB 組對蝦的血清葡萄糖、0.100% CB 組的血清尿素氮濃度顯著降低（P<0.05），0.050% CB 組血清磷濃度顯著上升（P<0.05）。與對照組相比，0.050% CB 組浮霉菌門Planctomycetes 和髕骨菌門Patescibacteria 豐度顯著提高（P<0.05）；0.050% 和0.075% CB 組弧菌屬Vibrio 的豐度顯著降低（P<0.05）。多樣性分析表明，0.050% 和0.075% CB 組的腸道菌群組成相似度更高，且明顯不同于對照組和0.100% CB 組。腸道內容物中5 種短鏈脂肪酸的含量均隨丁酸梭菌添加量的升高而增加。【結論】飼料中添加CB 芽孢制劑可能通過抑制腸道內潛在病原菌豐度、提高腸道短鏈脂肪酸的含量，改善營養物質的利用，從而提高凡納濱對蝦的生長性能。本研究中CB 芽孢制劑在飼料中的適宜添加量為2.50×105 或3.75×105 CFU/g。

關鍵詞： 凡納濱對蝦；丁酸梭菌芽孢；生長性能；腸道菌群；短鏈脂肪酸

中圖分類號： S963文獻標志碼： A 文章編號： 1001-411X（2023）02-0212-09

凡納濱對蝦Paneaus vannamei 為世界三大養殖蝦類之一。自1988 年引入中國以來，迄今已有40 多年的養殖歷史，2020 年全國養殖產量達到186.3 萬噸[1]。然而，隨著集約化養殖的加強，由于養殖密度過高、過度投喂以及飼料營養不均衡引發的腸道損傷問題頻發，由此導致對蝦消化吸收功能下降、免疫能力和生長受損，養殖成功率和養殖效益下降。因此，開發綠色、高效的對蝦腸道保健產品，成為保障凡納濱對蝦健康養殖的當務之急。

丁酸梭菌Clostridium butyricum （CB） 屬于芽孢桿菌科梭菌屬，是一種專性厭氧的革蘭陽性芽孢桿菌。自1933 年被發現、1935 年被分離及1992 年引入我國以來，其促進腸道健康的效果已在多種水產養殖動物如羅非魚[2]、石斑魚[3]、鰻鱺[4]、鮸魚[5]、鯉魚[6] 等中得到證實，其已知作用途徑主要包括增強腸道黏膜屏障功能、調節宿主腸道菌群、調節腸道pH，促進腸道對營養物質消化吸收等。丁酸梭菌于2009 年被我國正式批準作為新飼料添加劑使用，在當前國家養殖減抗、飼料替抗（生素） 的大背景下，其開發和應用將受到持續關注。

近年來的研究表明，飼用丁酸梭菌能改善克氏原螯蝦、羅氏沼蝦、日本囊對蝦的抗氧化功能，提高腸道消化酶活性，或改善腸道形態、調節腸道菌群結構[7-9]，說明丁酸梭菌在蝦類飼料中也具有潛在的應用價值。但將丁酸梭菌作為腸道健康產品應用于凡納濱對蝦的研究還比較缺乏。有研究表明，在飼料中分別添加丁酸梭菌活菌、芽孢、破碎菌體或活菌與發酵上清混合物，均能提高凡納對蝦生長性能，且丁酸梭菌活菌和破碎菌體皆可提高凡納對蝦對副溶血弧菌的抵抗力，綜合考慮生長性能、抗病力及產品保質期，丁酸梭菌芽孢更具有應用價值[10-11]。為此，本研究擬選用一種丁酸梭菌芽孢制劑，研究其對凡納濱對蝦生長性能、血清生化指標、腸道菌群及腸道內短鏈脂肪酸含量的影響，為明確丁酸梭菌芽孢制劑在凡納濱對蝦中的應用效果及探討其可能的作用途徑提供更多理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗飼料配制

以進口魚粉、小麥粉、去皮豆粕為主要蛋白源，精制魚油為脂肪源，配制凡納濱對蝦基礎飼料，基礎飼料配方及其營養水平測定值如表1 所示。丁酸梭菌菌株（DZNCB-1-105） 分離自土壤，其芽孢制劑由廣東大澤農生物科技有限公司提供，粉狀，活菌數為5×108 CFU/g。分別將質量分數為0（對照）、0.050%、0.075% 和0.100% 的丁酸梭菌添加到基礎飼料中，即飼料中的活菌數分別為0、2.50×105、3.75×105 和5.00×105 CFU/g，各處理簡稱為對照組（CK）、 0.050% CB 組、0.075% CB 組和0.100%CB 組。和其他飼料原料充分混合均勻后，用雙螺桿擠壓機制成直徑為1.5 mm 的4 種試驗飼料，于?20 ℃ 條件下保存。

1.2 試驗動物與飼養管理

凡納濱對蝦購于廣東省湛江市某對蝦養殖場，購回后放入廣東恒興集團“863”基地室內海水流水養殖系統中暫養2 周，暫養期間每日投喂基礎飼料4 次。暫養期結束后，挑選480 尾大小均勻、健康的幼蝦，初始體質量為（1.42±0.02） g，將幼蝦隨機分成4 組，每組設4 個重復，每個重復30 尾蝦，置于流水養殖系統的350 L PVC 水族箱中。分別投喂4 種試驗飼料，每日投喂4 次（07：00、11：30、16：00和20：30），日投飼率4%～6%，每3 d 根據蝦的攝食情況調整投飼率。試驗用水為經砂濾、臭氧消毒的天然海水，水溫（28±1） ℃，鹽度（22±2）‰。通過不定期進水、排污及充氧，保持溶氧為（8.0±0.2） mg/L，氨氮（0.04±0.003） mg/L。養殖試驗持續30 d。

1.3 樣品采集與分析

1.3.1 生長性能 養殖試驗結束時，每個水族箱的蝦稱質量、計數，統計飼料投喂量，計算各處理組對蝦的存活率、質量增加率和飼料系數。

存活率= 收獲尾數=放養尾數_100%;

質量增加率= （末質量初質量）=初質量_100%;

飼料系數= 投喂量=（末質量初質量）。

1.3.2 全蝦及基礎飼料的營養組成 每箱隨機取6 尾蝦，作為1 個重復，保存于?20 ℃ 條件下用于檢測全蝦體成分。分別采用105 ℃ 恒溫干燥法、凱氏定氮法、索氏抽提法及550 ℃ 灼燒法測定全蝦及基礎飼料的水分、粗蛋白、粗脂肪和粗灰分含量。

1.3.3 血清生化指標 每箱隨機取9 尾蝦，使用1 mL 注射器，從圍心腔抽取血淋巴，4 ℃ 靜置2 h后，使用冷凍離心機（Eppendorf，5425R）10 000r/min 離心10 min，取上層血清。每3 尾蝦的血清混合成1 個樣品，作為1 個重復，保存于?80 ℃ 條件下待測，每個處理12 個重復。血清生化指標用全自動生化分析儀（HITACHI，7 170 型） 根據專用試劑盒說明書進行檢測。

1.3.4 腸道菌群組成 每箱隨機取6 尾蝦，在冰盤上取出腸道內容物，混合后置于凍存管，作為1 個重復，迅速保存于?80 ℃ 條件下待測，每個處理4 個重復。用DNA Kit（Omega Biotek） 試劑盒提取腸道細菌基因組DNA。取合格樣本DNA 擴增16SrDNA 序列的V4 可變區。擴增引物為515F（5'-G T G C - C A G C M G C C G C G G - 3 ' ） 和8 0 6 R （ 5 ' -GGACTACH-VGGGTWTCTAAT-3'）。將PCR 產物進行定量檢測，之后按照每個樣品的測序量要求，進行相應比例的混合，構成測序樣品文庫。由I l l u m i n a M i S e q 測序儀采用M i S e q R e a g e n tKitv2（500-cycle） 完成測序。采用Qiime 平臺和RDP classifier 2.2 軟件對97% 相似水平的OTU 代表序列進行分類學分析，置信度閾值為0.8，并在各個分類水平統計每個樣品的群落組成。利用Mothur 軟件統計樣品的α 多樣性，結果用Sob、Chao、Ace、Shannon 以及Simpson 多樣性指數來表示。用QIIME v1.80 軟件統計分析樣品的β 多樣性指數，采用主坐標分析（Principal coordinatesanalysis，PCoA） 來進行數據統計分析，用PCoA 散點圖來表示不同處理之間的微生物群落物種組成的差異。

1.3.5 腸道內短鏈脂肪酸含量 每箱隨機取6 尾蝦，在冰盤上取出蝦腸道內容物，混合后置于1.5mL 無菌離心管中，作為1 個重復，置于?80 ℃ 冰箱中保存，每個處理4 個重復。取0.1 g 樣品于2.0mL 的Ep 管中，加入400 μL 體積分數為50% 的乙腈溶液、200 μL 的200 mmol/L 3-NPH 及200μL 的120 mmol/L EDC 溶液（含體積分數為6% 的吡啶） 渦旋1 min 混勻，40 ℃ 反應1 h，期間每隔5min 震蕩1 次；反應完成后12 000 r/min、4 ℃ 離心1 5 m i n，取上清液上機進行L C - M S / M S （美國WATERS 的液相色譜Waters Acquity UPLC 、美國SCIEX 的質譜AB SCIEX 5500 QQQ-MS ）。色譜分離條件：柱溫40 ℃，流速0.30 mL/min；流動相組成：A 為水（含φ 為0.1% 的甲酸），B 為乙腈（含φ 為0.1% 的甲酸）。運行8 min，進樣量6 μL。質譜分析條件：電子轟擊電離（ESI 離子源），離子源溫度4 5 0 ℃，離子源氣體3 5 a r b。選擇離子檢測（SIM） 進行定量分析。按照上述色譜及質譜條件進樣，利用MultiQuant 軟件進行積分，利用標準曲線進行相對濃度計算。

1.4 數據統計

用統計軟件SPSS 23.0 進行數據的分析統計，試驗數據用平均數±標準誤表示。結果先進行單因子方差分析（One-way ANOVA），再通過 Duncans多重比較分析數據之間的差異顯著性。

2 結果與分析

2.1 丁酸梭菌對凡納濱對蝦生長性能的影響

如表2 所示，各組對蝦的存活率為96.66%～100.00%。其中，0.100% CB 組存活率達到100.00%。與對照組相比，0.050% 和0.075% CB 組對蝦的末質量顯著提高（P<0.05）；其中0.050% CB 組質量增加率也顯著提高。飼料系數在丁酸梭菌各添加組有下降趨勢，但和對照組相比沒有統計學差異（P>0.05）。

2.2 丁酸梭菌對凡納濱對蝦營養組成的影響

如表3 所示，添加丁酸梭菌各組凡納濱對蝦的水分、粗蛋白、粗脂肪、粗灰分含量和對照組相比，均沒有顯著差異。

2.3 丁酸梭菌對凡納濱對蝦血清生化指標的影響

如表4 所示，和對照組相比，0.075% CB 組對蝦血清的葡萄糖濃度顯著下降；該組膽固醇、甘油三酯濃度也低于其他各組，但沒有統計學差異。隨著丁酸梭菌添加量的升高，血清尿素氮濃度呈下降趨勢，0.100% CB 組顯著低于對照組；而添加丁酸梭菌提高了血清磷濃度，在0 . 0 5 0 %CB 組達到顯著性水平?？偟鞍诐舛仍诟鹘M之間無顯著差異。

2.4 丁酸梭菌對凡納濱對蝦腸道內容物菌群組成的影響

表5 展示了各組豐度排名前10 位的菌門。和對照組相比， 丁酸梭菌各添加組浮霉菌門Planctomycetes 的豐度顯著升高，且在0.075%C B 組達到最高； 0 . 0 5 0 % C B 組髕骨菌門Patescibacteria 的豐度也顯著高于對照組。其余各菌門的豐度在組間差異不顯著。

在屬水平，和對照相比，0.050% 和0.075%CB 組弧菌屬Vibrio 豐度顯著下降，假交替單孢菌屬Pseudoalteromonas 豐度有下降趨勢；但后者在0.100% CB 組豐度反而呈升高趨勢。其余各屬在組間差異不顯著（表6）。

以97% 序列相似度為閾值生成OTU 后，計算不同樣品的5 個α 多樣性指數，并生成箱形圖，以分析樣品的α 多樣性（圖1 ） 。結果表明， S o b 、Chao、Ace 和Shannon 多樣性指數的變化趨勢一致：與對照組相比，0.050% 和0.075% CB 組對蝦腸道菌群的4 項指數較高；當進一步將添加量提高到質量分數為0.100% 時，4 項指數數值均下降，但各組之間差異不顯著。Simpson 多樣性指數亦在組間差異不顯著。β 多樣性分析表明，同一處理樣品基本聚為一簇，其中0.050% 和0.075% CB 組的樣本距離較接近，而對照組和0.100% CB 組與其他2 組樣本的距離較遠，表明0.050% 和0.075% CB 組物種組成較相似（圖2）。

2.5 丁酸梭菌對凡納濱對蝦腸道內短鏈脂肪酸含量的影響

隨著丁酸梭菌添加量的升高，對蝦腸道內5 種短鏈脂肪酸的含量均有不同程度的升高（表7）。和對照組相比，乙酸含量在0.050%、0.075% 和0 . 1 0 0 % CB 組分別升高了3 1 . 4 % 、9 8 . 1% 和182.5%；丙酸含量升高了6.7%、40.0% 和266.7%；丁酸含量升高了?10.0%、65.0% 和60.0%；戊酸含量升高了9.7%、95.6% 和140.7%，己酸含量升高了5.7%、68.6% 和117.1%。可見，飼料中添加丁酸梭菌總體上大幅增加了腸內5 種短鏈脂肪酸的含量。

3 討論與結論

3.1 丁酸梭菌對生長性能的影響

丁酸梭菌對動物的促生長作用與其生物學特性密切相關。該菌屬厭氧芽孢桿菌，在不良環境脅迫下能以孢子形式存在，具有更強的耐酸、耐膽鹽特性，能夠很好地在腸道定植而發揮作用。研究表明，丁酸梭菌能提高羅氏沼蝦[12]、日本沼蝦[13] 和斑節對蝦[14] 等的生長性能，本研究中適宜數量的丁酸梭菌顯著提高了凡納濱對蝦的生長性能，進一步表明蝦等無脊椎動物也可有效利用飼料中的丁酸梭菌，提高生長性能。

3.2 丁酸梭菌對血清生化指標的影響

血清生化指標可以反映出機體能量代謝和營養物質吸收能力。血清總蛋白和白蛋白含量的升高是機體蛋白質代謝旺盛的體現[15]，尿素氮是衡量動物體內蛋白質代謝和氨基酸平衡的一個重要指標，血清尿素氮的降低通常伴隨著蛋白質沉積的升高[16]。在豬和肉雞中的研究表明，飼料中添加丁酸梭菌可以顯著降低兩者血清尿素氮的濃度，并顯著提高血清總蛋白、白蛋白和球蛋白的濃度[16-17]。本研究也發現，添加丁酸梭菌可顯著降低對蝦血清尿素氮濃度，0.050% 和0.075% CB 組的總蛋白濃度也有升高趨勢；同時，還觀察到血清磷濃度的顯著升高。這可能是因為進入腸道的丁酸梭菌在腸道產生的短鏈脂肪酸促使腸道酸度增加，從而有利于某些有益菌的生長繁殖，增強消化酶活性，提高營養物質尤其是蛋白質及礦物元素的消化率[16]。血糖水平在一定程度上可以反映機體的合成代謝情況。本研究發現，飼料中添加質量分數為0.075% 的丁酸梭菌顯著降低了對蝦血糖水平。類似的研究包括，丁酸梭菌可以降低糖尿病小鼠的空腹血糖，改善糖尿病及相關代謝紊亂[18]；飼料中添加丁酸梭菌可降低豬對感染大腸埃希菌的應激反應，降低血糖水平[19]。但也有研究表明，飼料中添加丁酸梭菌能提高犢牛的生長性能和血清葡萄糖含量[20]。有關丁酸梭菌調節動物糖代謝的機制及效果，還需要更多的研究數據支持。

3.3 丁酸梭菌對腸道菌群的影響

本研究中，凡納濱對蝦腸道第一、二優勢菌分別是變形菌門和擬桿菌門，它們也是大多數研究中對蝦腸道的常見優勢菌[21-22]，豐度并未受飼料中丁酸梭菌的影響，表明它們可能是對蝦體內穩定的“核心菌群”[23]。和對照組相比，添加3 種不同質量分數的丁酸梭菌均顯著提高了對蝦腸道內浮霉菌門的豐度。浮霉菌門的成員在水生系統中普遍存在，包含多種厭氧氨氧化細菌，是高氨污染系統脫氮的生態友好型微生物[24]。郁維娜等[25] 的研究顯示，健康凡納濱對蝦腸道中浮霉菌門豐度顯著高于患病蝦，表明浮霉菌門的增殖有利于提高對蝦的健康水平。同時，飼料中添加質量分數為0.050% 和0.075% 的丁酸梭菌降低了對蝦腸道弧菌屬的豐度，對假交替單胞菌屬的豐度有降低的趨勢?；【鷮僦械暮芏喾N類是水產養殖業中常見的病原菌，其在腸道以及水體中豐度的升高常被視為蝦類弧菌病暴發的前奏[26]。Sumon 等[27]的研究表明，丁酸梭菌可以抑制羅氏沼蝦腸道內弧菌的生長；宋增福等[28] 使用腸細胞模型評估丁酸梭菌對鰻弧菌黏附能力的拮抗作用，發現丁酸梭菌有效抑制鰻弧菌對魚類腸道的黏附。假交替單胞菌是一種能產生多種胞外活性物質的海洋細菌屬，為對蝦養殖環境中的常見致病菌，有研究證實其具有較強的致腐能力，并且其在患病凡納濱對蝦中的豐度顯著高于健康組[25]。可見，添加丁酸梭菌能降低腸道中這些潛在病原菌的豐度，這可能與丁酸梭菌能夠通過改善腸道屏障功能來降低病原菌的入侵和定植，以及其含有的脂磷壁酸等益生成分抑制了病原菌對腸道細胞的黏附作用，或其代謝產物如短鏈脂肪酸的抑菌作用有關[29-30]。在本研究中，發現梭菌屬并非腸道內容物的優勢菌，推測丁酸梭菌對于腸道上皮細胞具有高黏附作用，大部分可定植在腸壁，而非直接進入腸腔，但需要通過細菌定植試驗進一步證實。

3.4 丁酸梭菌對腸道短鏈脂肪酸的影響

丁酸梭菌可在動物腸道發酵，產生以丁酸為主的短鏈脂肪酸，它們對動物腸道的能量供應、腸黏膜屏障的維持、腸道高敏感和腸道動力的調節、免疫調節等具有重要作用[31]。本研究發現，隨著丁酸梭菌添加量的升高，凡納濱對蝦腸道內容物中5 種短鏈脂肪酸（乙酸、丙酸、丁酸、戊酸和己酸） 的含量均顯著升高，這與D u a n 等[ 9 ] 在日本囊對蝦Marsupenaeus japonicus 中的研究結果一致。不同種類的短鏈脂肪酸或其衍生物對提高水產動物生長性能、調節營養代謝的作用也在多項研究中得到證實。如飼料中添加丙酸鈉可增加凡納濱對蝦對能量和磷的表觀消化率，調節其腸道微生物并促進凡納濱對蝦生長[32]；在飼料中添加丁酸鹽能夠顯著提高商業蝦采食量，改善其生長[ 3 3 ]；添加3%（w） 的β?羥基丁酸可改善凡納濱對蝦的生長性能、腸道消化酶活性及免疫水平，并增加其腸道短鏈脂肪酸含量[34]；在藍蟹Salvelinus alpinus 飼料中分別添加乙酸鈉、檸檬酸鈉、丁酸鈉或2%（w） 丙酸鈉等有機酸，均能夠促進藍蟹生長，促進其蛻皮，并提高其存活率[35]。目前關于戊酸對水產動物腸道健康的影響研究甚少，但研究發現，飼料中添加戊酸酯可降低小鼠腸道艱難梭菌的存活數[36]，且腸道菌群代謝產生的戊酸可防止小鼠的輻射損傷[37]。然而，本研究中也觀察到，添加丁酸梭菌至0.100%（w） 時，盡管腸道短鏈脂肪酸含量進一步升高，但對蝦的生長性能指標并未繼續升高，且腸道菌群組成和0.050% 及0.075% CB 組相比，發生了較大變化，表明短鏈脂肪酸的過量產生可能會使腸道pH 過低，導致腸道發生酸脅迫，從而破壞腸道菌群平衡[38]，影響對蝦的生長性能。

綜上，本研究證實，飼料中添加丁酸梭菌芽孢制劑可抑制腸道潛在病原菌的豐度、提高腸道短鏈脂肪酸的含量，改善腸道健康水平，從而改善營養物質的利用，提高凡納濱對蝦的生長性能。本試驗條件下，丁酸梭菌芽孢制劑在飼料中的適宜添加劑量為2.50×105 或3.75×105 CFU/g。

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【責任編輯 莊 延】