滇金絲猴毛首線蟲分子鑒定及其ITS序列分析

張譽(yù)方，張國春，謝昕言，楊建發(fā)，劉永張，賀君君

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，昆明，650201；2.昆明動(dòng)物園，昆明，650021）

滇金絲猴（Rhinopithecusbieti）又稱云南仰鼻猴，是一種僅在我國滇川藏地區(qū)分布的特有物種，喜群居生活，常在海拔2 000 m 以上的高山上活動(dòng)，數(shù)量稀少，被列為我國一級(jí)保護(hù)野生動(dòng)物。滇金絲猴常在地面進(jìn)食，再加上動(dòng)物園中圈養(yǎng)使其活動(dòng)范圍受限導(dǎo)致抵抗力下降，若不及時(shí)打掃清理糞便以及居住場(chǎng)所，很容易被寄生蟲感染。臨床上，圈養(yǎng)靈長類動(dòng)物對(duì)胃腸道寄生蟲較為敏感，尤其以毛首線蟲（Trichurisspp.）感染率高［1］。毛首線蟲是具有臨床重要性、高度土壤傳播流行性的4 種人類寄生蠕蟲之一，常寄生于豬、狗等哺乳動(dòng)物，1771 年發(fā)現(xiàn)毛首鞭形線蟲（Trichuristrichura）可感染人與靈長類［2］。基于形態(tài)學(xué)和宿主物種，目前大約有100 種毛首線蟲被確認(rèn)［3］。為達(dá)到保護(hù)野生動(dòng)物、持續(xù)利用野生動(dòng)物資源的目的，越來越多的滇金絲猴被人工飼養(yǎng)［4］，與此同時(shí)，圈養(yǎng)滇金絲猴之間、人和滇金絲猴之間的接觸更為密切，可能存在毛首線蟲交叉感染風(fēng)險(xiǎn)，從而引發(fā)人獸共患。

國內(nèi)對(duì)于毛首線蟲病（Trichuriasis）的相關(guān)報(bào)道多以圈養(yǎng)金絲猴為研究對(duì)象，謝翔［5］和鄭延益［6］分別對(duì)福州動(dòng)物園和貴陽森林野生動(dòng)物園的動(dòng)物進(jìn)行寄生蟲感染情況調(diào)查，其中靈長類毛首線蟲的感染率分別為31%和75%；賈婷等［7］采用形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)方法對(duì)北京動(dòng)物園圈養(yǎng)的滇金絲猴等3 種金絲猴進(jìn)行了寄生蟲普查，發(fā)現(xiàn)毛首線蟲感染嚴(yán)重。其他國家和地區(qū)如越南也有關(guān)于黑腿白臀葉猴（Pygathrix nigripes）感染毛首線蟲的報(bào)道［8］，大多集中在感染率和形態(tài)學(xué)鑒定，分子生物學(xué)的相關(guān)研究很少。

本研究基于ITS 序列對(duì)來自云南某動(dòng)物園滇金絲猴體內(nèi)分離獲得的線蟲進(jìn)行DNA 的提取和PCR 擴(kuò)增，分析基因序列并結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定種屬，對(duì)寄生蟲病防控進(jìn)行科學(xué)指導(dǎo)，并為滇金絲猴體內(nèi)線蟲的鑒別診斷、種群結(jié)構(gòu)的深入研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

2022 年1 月收到來自云南某動(dòng)物園送檢的滇金絲猴腸道線蟲，蟲體經(jīng)滅菌生理鹽水洗凈后置于70%乙醇中保存，待用。

1.2 方法

1.2.1 形態(tài)學(xué)鑒定

用生理鹽水將蟲體樣品清洗干凈，利用解剖顯微鏡觀察蟲體樣品的形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)，拍攝蟲體照片，進(jìn)行初步形態(tài)學(xué)鑒定。毛首鞭形線蟲的形態(tài)學(xué)特征：蟲體前部和后部之比為3∶2，整個(gè)蟲體如鞭狀，雌蟲的陰門開口于蟲體粗細(xì)交界處，雄蟲尾部向背面卷曲，有1 根交合刺［9］。鑒定完畢后，樣品保存于裝有70%乙醇的玻璃瓶中備用。

1.2.2 分子生物學(xué)鑒定

樣品DNA 制備：從70%乙醇保存液中取出4 條單個(gè)蟲體，用雙蒸水反復(fù)沖洗3次后，各蟲體分別取 1 cm，置于1.5 mL離心管中，命名為1、2、3、4；用滅菌的微型剪刀將蟲體組織剪碎，反復(fù)研磨，參考DNA提取試劑盒（糞便DNA 提取試劑盒購自天根生物科技有限公司）說明書提取4條蟲體DNA，DNA 樣品置于冰箱-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

PCR 擴(kuò)增ITS 序列：參考Luton 等［10］報(bào)道的 引物，擴(kuò)增此線蟲的ITS 序列，預(yù)期擴(kuò)增的目的片段大小約為1 200 bp，上游引物BD1（5'-GTCGTAACAAGGTTTCCGTA-3'，20 bp），下游引 物BD2（5'-TATGCTTAAATTCAGCGGGT-3'，20 bp），引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。反應(yīng)擴(kuò)增體系為50 μL：上、下游引物各2 μL，模板DNA

2 μL，雙蒸水19 μL，2×PCR MasterMix 25 μL。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30 個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸 5 min，16 ℃結(jié)束反應(yīng)，同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照。取5 μL PCR 產(chǎn)物進(jìn)行1%TAE 瓊脂糖凝膠電泳，用GelStain核酸染料染色，以DL2000 DNA Marker 作為參照，紫外投射儀下觀察結(jié)果，凝膠成像系統(tǒng)攝像。

1.2.3 ITS基因部分序列測(cè)定及系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

將陽性PCR 產(chǎn)物送測(cè)序公司雙向測(cè)序，拼接測(cè)序結(jié)果，并于NCBI進(jìn)行BLAST在線比對(duì)分析。利用MEGA 6.0軟件構(gòu)建進(jìn)化樹，以有齒食道口線蟲（Oesophagostomumdentatum）為外群，方法為相鄰法，Bootstrap置信值重復(fù)抽樣1 000次。

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)學(xué)觀察

蟲體長26.0～30.0 mm，前部細(xì)長，后部明顯短粗，顯微鏡下觀察到雌蟲的陰門位于蟲體前后交界處（圖1A），雄蟲有交合刺1 根（圖1B），經(jīng)反復(fù)對(duì)照文獻(xiàn)和寄生蟲形態(tài)分類圖譜［9］，結(jié)合蟲體照片，依據(jù)其形態(tài)初步確定為毛首線蟲（Trichurissp.）。

圖1 滇金絲猴毛首線蟲的顯微鏡觀察結(jié)果Fig.1 The results of the microscopic observation of Trichuris sp.

2.2 PCR擴(kuò)增結(jié)果

經(jīng)PCR 擴(kuò)增，4 條蟲體樣品成功擴(kuò)增出長度為 1 240、1 240、1 240、1 238 bp 的基因片段，與預(yù)期ITS基因目的片段長度相符，且無非特異性條帶，空白對(duì)照為陰性（圖2）。

圖2 滇金絲猴毛首線蟲ITS序列的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.2 PCR amplification of partial ITS sequences from the Trichuris sp.

2.3 ITS基因部分序列及系統(tǒng)進(jìn)化樹

BLAST 比對(duì)結(jié)果顯示，樣品與毛首線蟲（Trichurissp.）相似度高達(dá)99.05%。由圖3 可見，4 條線蟲樣品分離株與GenBank 中檢索到的登錄號(hào)為MN447324.1和KT186232.1來自中國的蟲株并入同一分支，表明這4 個(gè)樣品分離株與來自中國的川金絲猴（Rhinopithecusroxellana）和葉猴（Presbytissp.）體內(nèi)分離出的蟲株親緣關(guān)系最近；同時(shí)，4 個(gè)樣品與登錄號(hào)為AM992995.1 和AM992996.1 來自中國成年人感染的毛首線蟲種匯在同一個(gè)大的分支，進(jìn)而與登錄號(hào)為GQ301551.1 和GQ301553.1 來自南非的阿拉伯狒狒（Papio hamadryas ursinus）感染的毛首線蟲種匯于一大分支；而來自非人靈長類和嚙齒類2種宿主的序列按照宿主分別匯成分支，呈現(xiàn)出不同的宿主分化趨勢(shì)。

圖3 基于ITS構(gòu)建的毛首線蟲種系發(fā)育進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree based on Trichuris sp.ITS sequences

3 分析與討論

毛首線蟲又稱鞭蟲，是一種呈世界性分布的多宿主寄生蟲，靈長類動(dòng)物對(duì)毛首鞭形線蟲［11］、豬鞭蟲（Trichuris suis）［12］、羊鞭蟲（T.ovis）［13］、皮翼毛首線蟲（T.cynocephalus）以及川金絲猴毛首線蟲新種（Trichocephalus rhinopiptheroxella）［14-15］易感，但不同的靈長類動(dòng)物對(duì)毛首線蟲的感染率不同［16］，感染后常表現(xiàn)為食欲不振、生長不良、頑固性腹瀉等癥狀，且糞便呈黑褐色水樣；人類尤其是兒童對(duì)于T.trichiura、T.suis［17］表現(xiàn)為易感，發(fā)病時(shí)通常表現(xiàn)為精神沉郁、營養(yǎng)不良、生長遲緩、腸系膜異位癥［18］及腸炎等［19］。

人類活動(dòng)范圍的擴(kuò)大不僅讓金絲猴的生存環(huán)境被破壞，同時(shí)也帶來了更多的疾病，尤其是寄生蟲病嚴(yán)重威脅著靈長類動(dòng)物的健康［20］。毛首線蟲病不僅嚴(yán)重威脅靈長類動(dòng)物的機(jī)體健康，且存在人獸共患及交叉感染風(fēng)險(xiǎn)，容易造成嚴(yán)重的公共衛(wèi)生事件，因此有關(guān)靈長類動(dòng)物的毛首線蟲感染報(bào)道還需更完善深入地調(diào)查和研究。

3.1 案例回顧

本研究中，該滇金絲猴生前食欲廢絕，精神沉郁，頑固性腹瀉，糞便呈黑褐色水樣，血液檢查有貧血癥狀［21］；剖檢見部分腸黏膜組織脫落，結(jié)腸黏膜出血性壞死，這與文獻(xiàn)報(bào)道感染毛首線蟲的臨床癥狀［22］基本一致，由此推測(cè)感染了毛首線蟲；顯微鏡下觀察腸道內(nèi)成蟲蟲體前部細(xì)長，后部明顯短粗，雌蟲的陰門位于蟲體粗細(xì)交界處，雄蟲具有1 根交合刺，所觀察蟲體形態(tài)學(xué)與寄生蟲圖譜［9］中對(duì)于毛首線蟲的描述一致，初步鑒定為毛首線蟲。線蟲ITS 序列分析結(jié)果顯示樣品與毛首線蟲相似度最高，達(dá)99.05%，最終判定這只滇金絲猴感染了毛首鞭形線蟲。

3.2 原因分析

靈長類動(dòng)物對(duì)毛首線蟲極為敏感，感染率高達(dá)80%以上，嚴(yán)重可引起發(fā)病甚至死亡［23］，且存在重復(fù)感染現(xiàn)象［24］。作為土源性寄生蟲，毛首線蟲不需要中間宿主，在盲腸產(chǎn)出的蟲卵隨著宿主糞便排出體外并污染周圍土壤，易感動(dòng)物通過接觸被污染的糞便或土壤經(jīng)口感染。進(jìn)入宿主體內(nèi)的蟲卵會(huì)在小腸發(fā)育成幼蟲，進(jìn)入腸黏膜攝取營養(yǎng)，一段時(shí)間后重新回到盲腸段發(fā)育成成蟲［25-26］。由于靈長類動(dòng)物是群居動(dòng)物，誤食毛首線蟲卵后，通過一起玩耍、進(jìn)食、抱團(tuán)等形式，極易增大毛首線蟲病的傳播和感染概率［27］。

本研究中，滇金絲猴發(fā)病距開始救助的時(shí)間較長，推測(cè)有可能是在園區(qū)內(nèi)誤食了攜帶有感染性幼蟲的食物或糞便，且長期關(guān)在籠舍內(nèi)，運(yùn)動(dòng)量較少，機(jī)體免疫力下降，導(dǎo)致毛首線蟲卵在體內(nèi)大量繁殖。

3.3 人獸共患風(fēng)險(xiǎn)分析

有研究報(bào)道，人類偶爾會(huì)被外陰錐蟲（T.vulpis）和豬鞭蟲感染，它們被認(rèn)為是人獸共患的蟲種［28-30］。近年來有學(xué)者將鞭蟲作為自身免疫性疾病的一種治療選擇，如炎癥性腸病［31-32］，這激發(fā)了人們對(duì)人類、非人靈長類和其他近緣物種的毛首線蟲分類地位及其人獸共患潛力的調(diào)查研究［33］。傳統(tǒng)意義上，靈長類動(dòng)物的鞭蟲被稱為毛首線蟲（或更保守的說是毛首線蟲屬），最近的分子證據(jù)表明，存在多個(gè)感染靈長類動(dòng)物的毛首線蟲蟲種，但沒有明確定義其物種邊界及其傳播給人類的可能性［33］。

本研究通過系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖3）可見，來自非人靈長類和嚙齒類動(dòng)物體內(nèi)的毛首線蟲分離株匯聚在兩大分支，與Ravasi 等［30］提出的不同種毛首線蟲對(duì)于宿主的主觀偏好存在差異的結(jié)論趨向一致；成年人和南非阿拉伯狒狒的毛首線蟲蟲株聚合到一個(gè)大分支，佐證了Ravasi 等［30］曾指出的毛首線蟲在南非的狒狒和人類之間存在潛在交叉感染，系統(tǒng)發(fā)育分析表明2 種宿主均被2 個(gè)不同的蟲種感染。同時(shí)本研究結(jié)果支持李梅等［34］基于ITS 基因序列構(gòu)建的進(jìn)化樹得出的人和非人靈長類動(dòng)物感染的毛首線蟲是近緣種這一結(jié)論。其他相關(guān)研究也說明，毛首線蟲存在嚴(yán)重的人獸共患風(fēng)險(xiǎn)［16，35-37］，具有潛在的交叉感染可能。

3.4 防控建議

毛首線蟲病是人與動(dòng)物常見的寄生蟲病，呈世界性分布，多分布于熱帶地區(qū)，是一種容易被忽視的熱帶寄生蟲病［38］。對(duì)于本病的發(fā)生，多與園區(qū)的飼養(yǎng)管理不善有關(guān)；其次，溫濕的環(huán)境有助于毛首線蟲卵的發(fā)育，導(dǎo)致重復(fù)感染。做好預(yù)防措施能夠有效地防止毛首線蟲感染，一方面要注意籠養(yǎng)環(huán)境的保持，另一方面對(duì)于感染毛首線蟲的滇金絲猴要及時(shí)進(jìn)行隔離和驅(qū)蟲處理，盡量避免與健康的滇金絲猴接觸，并定期采集糞便檢查以觀察驅(qū)蟲效果［21］。

毛首線蟲作為一種人獸共患寄生蟲，有潛在的交叉感染可能，存在人獸共患風(fēng)險(xiǎn)。滇金絲猴通過人工養(yǎng)殖或動(dòng)物園觀賞表演與其他動(dòng)物或人產(chǎn)生的密切接觸可能引發(fā)毛首線蟲感染風(fēng)險(xiǎn)，誘發(fā)其他疾病，對(duì)人類健康及公共衛(wèi)生安全有著嚴(yán)重的負(fù)面影響，故不能輕視。