不同環(huán)境條件下川金絲猴的皮質(zhì)醇和Klotho激素水平變化

王 偉，程銘昊，趙思棋，蔣 軍，由玉巖，孫冬婷，黃天鵬，吳 鋒，劉連貴，張于光，劉學(xué)鋒

（1.圈養(yǎng)野生動(dòng)物技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京，100044；2.北京動(dòng)物園管理處，北京，100044；3.中國林業(yè)科學(xué)研究院森林生態(tài)環(huán)境與自然保護(hù)研究所，國家林業(yè)和草原局生物多樣性保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京，100091；4.神農(nóng)架國家公園，神農(nóng)架林區(qū)，442421）

隨著技術(shù)的發(fā)展，利用生理激素對(duì)野生動(dòng)物監(jiān)測(cè)已經(jīng)成為野生動(dòng)物管理的重要手段［1-3］。皮質(zhì)醇（Cortisol）等類固醇激素參與動(dòng)物的應(yīng)激反應(yīng)，當(dāng)受到不良刺激時(shí)，皮質(zhì)醇激素釋放量會(huì)增加，因此可以利用該激素的變化監(jiān)測(cè)動(dòng)物對(duì)環(huán)境變化的響應(yīng)［4-5］。皮質(zhì)醇激素的研究涉及黑尾近紅鲌（Ancherythroculter nigrocauda）、麋鹿（Elaphurus davidianus）、東北虎（Panthera tigris altaica），以及猩猩（Gorilla gorilla）、狒狒（Papio cynocephalus cynocephalus）、短尾猴（Macaca thibetana）和滇金絲猴（Rhinopithecus bieti）等靈長類動(dòng)物，探討了不同環(huán)境壓力、季節(jié)、食物和社群結(jié)構(gòu)等對(duì)皮質(zhì)醇激素的影響［6-12］。Zhang等［13］研究表明，社會(huì)結(jié)構(gòu)的變化對(duì)川金絲猴（Rhinopithecus roxellana）個(gè)體皮質(zhì)醇水平?jīng)]有顯著影響；楊亮亮［14］研究發(fā)現(xiàn)川金絲猴野外補(bǔ)食群全年皮質(zhì)醇水平與等級(jí)關(guān)系呈負(fù)相關(guān)，不同個(gè)體的皮質(zhì)醇激素水平會(huì)隨季節(jié)波動(dòng)。

Klotho（K）基因是一種與衰老有關(guān)的基因，K基因缺失的小鼠會(huì)加速衰老，生長受到阻滯，身體機(jī)能下降［15］。分泌型Klotho 蛋白對(duì)氧化應(yīng)激具有重要的調(diào)節(jié)作用，并對(duì)抑制衰老相關(guān)的炎癥反應(yīng)和內(nèi)質(zhì)膜應(yīng)激等發(fā)揮作用［16］。目前，K基因的相關(guān)研究均圍繞其在心血管、腎臟、神經(jīng)性損傷和癌癥等臨床醫(yī)學(xué)疾病中發(fā)揮的作用［17-19］，尚未見到利用該蛋白對(duì)野生動(dòng)物健康監(jiān)測(cè)的研究報(bào)道。

川金絲猴是我國特有的國家一級(jí)重點(diǎn)保護(hù)野生動(dòng)物，主要分布在四川、陜西、湖北和甘肅等地［20］。本研究以川金絲猴野外補(bǔ)食群和籠養(yǎng)群為對(duì)象，分析其糞便皮質(zhì)醇和Klotho 激素水平在不同環(huán)境和季節(jié)中的變化規(guī)律，以及激素水平與個(gè)體性別的關(guān)系，以期獲得環(huán)境壓力和季節(jié)變化與川金絲猴壓力激素變化的關(guān)系，為科學(xué)制定川金絲猴的保護(hù)管理策略提供依據(jù)。

1 研究方法

1.1 研究對(duì)象

研究對(duì)象包括神農(nóng)架國家公園的大龍?zhí)洞ń鸾z猴野外補(bǔ)食群（wild group，WG）、神農(nóng)架姊妹峰的籠養(yǎng)群（Zimeifeng captive group，ZCG）和北京動(dòng)物園籠養(yǎng)群（Beijing Zoo captive group，BCG）。WG 外自由采食，除偶爾有人為食物補(bǔ)充外，無其他人為干擾；ZCG 和BCG 均為人工繁育種群，ZCG 飼養(yǎng)1 或2 代；BCG已飼養(yǎng)多代；籠養(yǎng)群投喂的食物種類基本一致。

1.2 樣本采集

分別于2018年秋季（9月）、冬季（12月）、2019年春季（3 月）和夏季（6 月）晴天的13：00—15：00 采集川金絲猴糞便樣本。采集時(shí)，盡量采集新鮮糞便，盡量標(biāo)記糞便來源個(gè)體的性別、年齡組別（成年、亞成年、幼體）和采樣時(shí)間等。在每個(gè)地點(diǎn)，每批次至少采集5 個(gè)個(gè)體，樣本放入采樣袋后在冰箱-20 ℃保存［21］。共采集3 個(gè)種群的川金絲猴糞便樣本238份（表1）。

表1 川金絲猴野外補(bǔ)食群和籠養(yǎng)群糞便樣本采集數(shù)量Tab.1 Number of fecal samples of golden snub-nosed monkeys collected from wild group and captive groups

1.3 樣本預(yù)處理和測(cè)定

1.3.1 皮質(zhì)醇預(yù)處理

參照Nugraha等［22］的方法，取糞樣2 g，55 ℃烘干研磨，去除毛、草等雜質(zhì)后，稱取干粉0.1 g 置于 10 mL 的80%乙醇中，60 ℃水浴20 min，取上清液 6 mL。再加5 mL 的80%乙醇二次浸提，60 ℃水浴20 min，再取上清液4 mL 混合得到10 mL 上清液。在坩堝中55 ℃烘干后，再加入1 mL 甲醇溶解，待檢測(cè)。

1.3.2 Klotho預(yù)處理

取干燥糞便10 mg 置于0.1 mL PBS 緩沖液中稀釋，超聲粉碎后于5 000g轉(zhuǎn)速離心10 min，取上清液，待檢測(cè)。

1.3.3 激素測(cè)定

樣本測(cè)定使用皮質(zhì)醇和Klotho ELISA 檢測(cè)試劑盒（購自北京方程BIOFINE 公司）。具體方法：將標(biāo)準(zhǔn)品稀釋5 個(gè)梯度，各個(gè)梯度每孔加樣量均為 50 μL，分別設(shè)置空白孔、標(biāo)準(zhǔn)品孔和待測(cè)樣品孔，待測(cè)樣品每份重復(fù)3 次。在待測(cè)樣品孔中先加樣品稀釋液40 μL，再加待測(cè)樣品10 μL；用封板膜封板后置于37 ℃下溫育30 min。將30 倍濃縮洗滌液用蒸餾水30 倍稀釋后備用；揭去封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30 s 后棄去，重復(fù)5 次，甩干。向每孔加入酶標(biāo)試劑50 μL，空白孔除外；再次封板后置37 ℃溫育30 min。重復(fù)上述洗滌過程。每孔先加入顯色劑A 50 μL，再加入顯色劑B 50 μL，輕輕震蕩混勻，37 ℃避光顯色15 min。每孔加終止液50 μL，終止反應(yīng)。使用空白孔調(diào)零，450 nm 波長依序測(cè)量各孔的OD 值。測(cè)定在加終止液后15 min 內(nèi)進(jìn)行。最終以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為縱坐標(biāo)，OD 值為橫坐標(biāo)，計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的多項(xiàng)式二次回歸方程，將樣品的OD 值代入方程式，計(jì)算出樣品濃度，再根據(jù)相應(yīng)的稀釋倍數(shù)，計(jì)算出樣品的實(shí)際濃度。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS 17.0 軟件處理數(shù)據(jù)，以mean±SD 表示，組間比較采用one-way ANOVA 檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 皮質(zhì)醇激素水平的季節(jié)變化和環(huán)境差異

表2顯示，WG和ZCG 的皮質(zhì)醇激素水平具有基本一致的季節(jié)變化規(guī)律，春季激素水平開始升高，秋季達(dá)到最大值，隨后下降。WG在春季的皮質(zhì)醇激素水平極顯著（P＜0.01）低于秋季，而BCG 在夏季皮質(zhì)醇水平極顯著（P＜0.01）高于其他季節(jié)，ZCG 在秋季皮質(zhì)醇水平最高，但與其他季節(jié)無顯著差異。不同環(huán)境條件下川金絲猴的皮質(zhì)醇激素水平存在明顯差異：WG的皮質(zhì)醇激素水平總體低于2個(gè)籠養(yǎng)群；春季時(shí)，BCG的皮質(zhì)醇激素水平顯著高于WG（P＜0.05），秋季時(shí)BCG顯著低于ZCG（P＜0.05），而夏季和冬季3個(gè)種群間皮質(zhì)醇激素水平無顯著差異（表2）。

表2 川金絲猴糞便皮質(zhì)醇的季節(jié)變化和環(huán)境差異Tab.2 Cortisol mass fraction in different seasons and from different groups ng·g-1

2.2 Klotho激素水平的季節(jié)變化和環(huán)境差異

WG的Klotho水平在春季顯著低于夏季和冬季（P＜0.05），ZCG 的Klotho 水平在春季顯著高于夏季（P＜0.05），而BCG變化趨勢(shì)雖然與ZCG相似，但是BCG的總體水平高于ZCG種群，而且BCG的Klotho水平無顯著季節(jié)差異（表3）。春季，WG的Klotho激素水平極顯著低于ZCG 和BCG（P＜0.01），而ZCG 和BCG 間無顯著差異，其他季節(jié)3個(gè)種群間均無顯著差異（表3）。

表3 川金絲猴糞便Klotho的季節(jié)變化和環(huán)境差異Tab.3 Klotho mass fraction in different seasons and from different groups ng·g-1

2.3 皮質(zhì)醇激素和Klotho激素水平相關(guān)性

對(duì)不同環(huán)境條件下川金絲猴個(gè)體的皮質(zhì)醇激素和Klotho 激素相關(guān)性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)激素間無相關(guān)性（r=-0.056）。從全年的分析來看，BCG 的皮質(zhì)醇激素水平為800～1 400 ng/g，而WG 和ZCG 的皮質(zhì)醇激素水平變化十分明顯，但是Klotho 的水平在不同群體間的變化相似（圖1）。

圖1 全年不同種群的川金絲猴皮質(zhì)醇和Klotho激素相關(guān)性Fig.1 Correlation analysis of cortisol and Klotho hormones in golden snub-nosed monkeys from different groups over a year

2.4 籠養(yǎng)群不同性別川金絲猴壓力激素水平差異

選取來自ZCG 和BCG 的160個(gè)糞便樣本進(jìn)行壓力激素相關(guān)性分析，結(jié)果表明，雌性與雄性個(gè)體之間差異不顯著，無明顯相關(guān)性（圖2）。

圖2 籠養(yǎng)群不同性別川金絲猴激素水平相關(guān)性Fig.2 Stress hormone level in captive group by genders

3 討論

皮質(zhì)醇和Klotho 都是哺乳動(dòng)物用于應(yīng)對(duì)外部變化及自身調(diào)控所必須的激素。皮質(zhì)醇是動(dòng)物受到刺激時(shí)，體釋放的用于調(diào)控自身代謝的激素，Klotho 則是與抗衰老相關(guān)的激素，還與各種疾病的發(fā)生相關(guān)［23］，其水平高低可表征身體健康狀況，研究這2 種壓力激素，可以對(duì)動(dòng)物的身體狀況進(jìn)行評(píng)估［1-4］。本研究發(fā)現(xiàn)，北京動(dòng)物園籠養(yǎng)群的皮質(zhì)醇激素水平變化與當(dāng)?shù)販囟茸兓?guī)律一致，夏季皮質(zhì)醇激素水平顯著高于其他時(shí)期。由于北京地區(qū)夏季持續(xù)高溫，最高氣溫可達(dá)38 ℃，持續(xù)高溫帶來的慢性熱刺激，可促進(jìn)下丘腦促腎上腺皮質(zhì)激素釋放，最終導(dǎo)致皮質(zhì)醇激素過度分泌，這與謝愛純等［24］對(duì)香豬的研究結(jié)果一致。神農(nóng)架野外補(bǔ)食群的皮質(zhì)醇激素水平在秋季顯著高于春季和冬季。神農(nóng)架姊妹峰籠養(yǎng)群的川金絲猴皮質(zhì)醇激素水平在秋季最高，但與其他季節(jié)相比無顯著差異，可能是由于神農(nóng)架地區(qū)秋季氣溫驟降明顯，急性冷應(yīng)激條件下，動(dòng)物交感—腎上腺軸容易激活，使糖皮質(zhì)激素分泌增加以調(diào)節(jié)機(jī)體適應(yīng)性和體內(nèi)平衡，因此秋季激素水平升高。同時(shí)秋季也是川金絲猴的繁殖期，處于繁殖期的個(gè)體因繁殖壓力也會(huì)造成皮質(zhì)醇激素水平升高。

對(duì)不同環(huán)境的個(gè)體分析發(fā)現(xiàn)，春季川金絲猴野外補(bǔ)食群的皮質(zhì)醇激素和Klotho激素水平顯著低于2個(gè)籠養(yǎng)群。皮質(zhì)醇激素水平低可能是春季氣溫回升、食物增多，生活在野外的川金絲猴生存壓力減小；春季Klotho激素水平較低可能是因?yàn)槎具\(yùn)動(dòng)量減少及身體健康程度下降，隨著氣溫回升，川金絲猴活動(dòng)量增加，自夏季之后Klotho激素的水平開始逐漸增加。

對(duì)來自不同環(huán)境的川金絲猴個(gè)體糞便樣本分析還發(fā)現(xiàn)，籠養(yǎng)群的皮質(zhì)醇激素水平的變化幅度比野外補(bǔ)食群更小。生活在動(dòng)物園的川金絲猴環(huán)境相對(duì)穩(wěn)定、食物資源豐富，皮質(zhì)醇激素水平也比較穩(wěn)定；而野外種群需要適應(yīng)不斷變化的環(huán)境條件，容易受到不良環(huán)境的刺激，因此激素水平變化明顯。

本研究探明了川金絲猴野外種群和籠養(yǎng)群的壓力激素隨季節(jié)變化的差異，首次檢測(cè)了川金絲猴糞便中的Klotho激素，并嘗試分析了2種激素之間和激素與川金絲猴個(gè)體所處環(huán)境條件、性別間的相關(guān)性，對(duì)川金絲猴的保護(hù)管理和飼養(yǎng)繁育具有重要的參考意義。