糞便顆粒大小對大熊貓類固醇激素測定的影響

楊 波 ，唐 丹 ，趙蘭蘭，杜 鍇，徐 翔，李德紅，潘 超，李 蓉，龔海兵，胡榮強，林冰森，羅 波，黃 炎

（1.中國大熊貓保護研究中心，大熊貓國家公園珍稀動物保護生物學國家林業和草原局重點實驗室，邛崍山、岷山瀕危野生動植物保護生物學國家長期科研基地，都江堰，611830；2.簡陽市規劃和自然資源局林業服務中心，簡陽，641400；3.丹巴縣農牧農村和科技局，丹巴，626300）

非損傷性取樣（noninvasive sampling）被廣泛應用于瀕危野生動物內分泌研究，主要來源于糞便、尿液、唾液、毛發和含口腔脫落細胞的食物殘渣等［1］，其中糞便樣品更易獲得，適用于動物類固醇激素監測。類固醇激素可以較好地衡量動物繁殖狀態、應激水平和健康狀況等［2-3］。大熊貓（Ailuropoda melanoleuca）作為國家一級重點保護野生動物，其野生生存狀態和圈養種群管理狀況備受關注。考慮到大熊貓野生個體的難覓性和圈養種群的動物福利，為了更有效地監測大熊貓的生理狀況和評估其身體健康水平，糞便類固醇激素監測成為首選方法。對大熊貓而言，糞便皮質醇（cortisol，CORT）激素可用于分析自然環境因子（噪音、光照和高溫等）［4-6］、特殊事件（麻醉、運輸和放歸）［6-8］對其造成的短期干擾應激，也可以進行長期監測以分析生活環境改變對其造成的生理影響［9］或研究圈養環境下特殊行為發生的生理機制［10］。除此以外，糞便類固醇性激素可以對雌/雄性大熊貓發情狀態進行動態監測，有效地評估其繁殖生理情況［11-12］，還可以用于性別鑒定［13］等。

糞便類固醇激素的測定可能受到糞樣采集、保存、運輸和處理的影響［2］。已有研究得出大熊貓糞便類固醇激素含量受到糞便激素不均勻分布［14］、新鮮程度［15］、貯存條件［15］和取樣量［16］等因素影響。目前常用真空冷凍干燥法干燥糞便和乙醇提取法萃取類固醇激素［6，9，13-14，17］。有文獻［14，17］提及凍干后的糞便在粉末化處理過程中需要充分研磨，但研磨程度并未說明。因此，本研究利用不同孔徑篩網對凍干后的糞便進行篩取以量化糞便顆粒大小，并測定糞便類固醇以探究糞便顆粒大小與激素含量的相關性，以期為大熊貓糞便類固醇激素研究提供一定的方法借鑒，也為大熊貓非損傷性取樣研究提供有價值的參考。

1 材料與方法

1.1 研究材料

中國大熊貓保護研究中心10 只成年雌性大熊貓的糞便，糞便類型為竹葉便和竹節便。試驗期間個體健康狀況良好。

1.2 樣品采集與處理

2020 年7 月某一周，09：00—12：00 采集大熊貓新鮮糞便，使用一次性PE 手套將糞便放入自封袋，標注供者名稱、日期、時間和糞便類型等信息，1 h內帶回實驗室，-20 ℃凍存，共收集竹葉便21 份、竹節便28 份。樣品收集完畢，利用真空冷凍干燥機（北京亞星儀科LGJ-100FG）干燥樣品至恒重。分別混合竹葉便和竹節便，用手輕揉糞便（避免扎傷），取出大塊竹葉和竹節。充分混合后，依次使用3.35 mm（6 目）、1.70 mm（10 目）、0.88 mm（18 目）、0.43 mm（35 目）、0.23 mm（65 目）和0.12 mm（120 目）孔徑篩網篩取糞便粉末。具體操作：先使用3.35 mm 篩網篩選混合樣，水平勻速篩選3次，用12 mm×75 mm 的玻璃試管取滿篩下物（即糞便粉末），封口；再使用1.70 mm 篩網對剩余的篩下物進行篩選，再用試管取滿篩下物；按照該方法依次完成剩余篩網的篩取操作。篩取后的糞便粉末置于-80 ℃保存。

1.3 激素提取與測定

操作方法和測定方法參考唐丹等［7］。利用90%乙醇萃取糞便中類固醇激素，每個糞樣激素提取 3次，具體操作：將每管糞便粉末（約1.2 g）從上至下均分為3 個部分（上部、中部和下部），將每部分糞樣混合均勻后再從中各取出0.1 g用于激素提取；提取液置于-20 ℃凍存，待檢測；采用酶聯免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）測定提取液中類固醇激素，包括雌酮-3-葡糖苷酸（estrone-3-glucuronide，E1G）、孕 酮（progesterone，P4）和CORT。單克隆抗體E1G R583、P4 CL425 和CORT R4866 來源于美國加州大學戴維斯分校人口健康與生殖系臨床內分泌學實驗室，由Coralie Munro 研發［11-12］。每種激素重復測定3板次，每板次2個重復。

1.4 數據處理與分析

激素測定的批內變異系數≤6%，批間變異系數≤10%。試驗選取3 個因子：第1 個因子為糞便類型，分為竹葉便和竹節便；第2 個因子為取樣部位，分為取樣試管的上部、中部和下部3 個區組水平；第3 個因子為篩網孔徑，試驗包含3.35、1.70、0.88、0.43、0.23、0.12 mm 6個孔徑水平。將以上各因子進行組合，共36個試驗單元，每個單元設3×2個重復。利用SPSS 22.0處理數據，使用三因素析因設計一元定量資料方差分析對各因素的主效應和交互作用進行分析，建模時糞便類型歸入隨機因子，取樣部位和篩網孔徑為固定因子。各因子存在顯著效應時，再進行簡單效應分析、相關性分析（Pearson）或配對t檢驗分析（one sample Kolmogorov-Smirnov test 檢驗均為正態分布）。計量結果用mean±SD表示，顯著水平設置為α=0.05。

2 結果

2.1 篩網孔徑對激素的影響

三因素析因設計方差分析顯示，無論在竹葉便還是竹節便中，取樣部位與篩網孔徑在3 個指標（E1G、P4 和CORT 含量）下均不存在交互作用（P=0.585、0.997、0.121、0.881、0.877 和0.668），篩網孔徑在3 個指標下均存在主效應。以篩網孔徑為比較的簡單效應分析顯示，竹葉便中的E1G、P4 和CORT 含量在不同篩網孔徑間的差異性存在不同表現（圖1A1-A3），E1G 和CORT 含量在不同孔徑間的差異不存在統計學意義（P=0.052、0.652），而P4 含量有顯著差異（P＜0.001），并且激素含量與孔徑存在顯著負相關性（r=-0.617，P＜0.001）。進一步分析顯示，竹葉便P4 含量在3.35 mm 與1.70 mm 孔徑下最低，且均與0.88 mm存在顯著差異性（P＜0.05），與0.43、0.23、0.12 mm 間存在 極顯著 差異性（P＜0.001），并且0.88 mm 與0.43、0.23、0.12 mm 間也存在顯著差異性（P≤0.015），其余組間的差異無統計學意義。根據各組間的差異特性，可將3.35、1.70 mm 視為一個整體水平，為（463.8±75.6）ng/g；0.88 mm 為一個水平，為（634.4±174.0）ng/g；0.43、0.23、0.12 mm為一個整體水平，為（863.5±208.8）ng/g。

圖1 糞便顆粒徑對大熊貓糞便激素含量的影響Fig.1 Effect of fecal partide size on fecal steroids content of giant panda

竹節便中E1G、P4 和CORT 含量與篩網孔徑均存在顯著負相關性（r=-0.804、-0.786、-0.643，P＜0.001）（圖1B1-B3），激素含量大致呈現隨篩網孔徑增加而減少的趨勢。E1G、P4含量在各組間（不同孔徑）的差異性特征與竹葉便P4 相似，也可將3.35、1.70 mm 視為一個整體水平，0.88 mm 為一個水平，0.43、0.23、0.12 mm 為一個整體水平。而CORT 含量的差異表現有所不同，具體表現為3.35、1.70、0.88 mm 間的差異不顯著（P≥0.139），0.43、0.23、0.12 mm間也不顯著（P≥0.392），0.88 mm與0.43 mm同樣不存在顯著差異性（P=0.107）；其余組間的差異顯著（P≤0.039）。因此，可將3.35、1.70、0.88 mm視為一個整體水平，為（203.6±35.4）ng/g；0.43、0.23、0.12 mm為一個整體水平，為（274.1±38.1）ng/g。或將3.35、1.70 mm，0.88、0.43 mm，0.23、0.12 mm視 為3 個不同 的水平，分別為（194.8±34.5）、（241.5±39.2）、（280.3±37.7）ng/g。

2.2 取樣部位對激素的影響

不同取樣部位在3 個指標（E1G、P4 和CORT）上均表現出極顯著差異性（P＜0.001）。進一步對各組間差異性進行配對t檢驗顯示：竹葉便E1G 與P4，上部與中部均不存在顯著差異（t=-1.915、-0.506，P=0.114、0.634），其余各組間均存在顯著差異性（t≤-2.642，P≤0.046）（圖2A1-A2）；而CORT 在各組間的差異均顯著（t≤-3.957，P≤0.011，圖2A3）。竹節便E1G 與P4 只在中部與下部間存在不顯著差異（t=-1.970、-0.994，P=0.106、0.366），其余各組間的差異均顯著（t≤-3.622，P≤0.015）（圖2B1-B2）；CORT在各組間的差異性均顯著（t≤-8.230，P＜0.001，圖2B3）。

圖2 取樣管中不同部位的糞便激素含量Fig.2 The difference of fecal steroids content in the top，middle and bottom of sampling pipe

3 討論

大熊貓主食竹類，食物殘渣通過腸道會混合大量的消化液和類固醇激素等代謝產物。由于大熊貓不能消化竹纖維，不同程度大小的竹纖維（竹葉或竹節）是否會影響激素含量測定需要進行驗證。因此，本研究利用篩網剔除不同尺寸的竹葉或竹節，量化糞便顆粒大小以探究其與激素含量的相關性，進而探討竹纖維的影響程度以降低糞便處理可能造成的試驗誤差，提高檢測準確性。結果顯示，3.35、1.70 mm孔徑篩下物的激素含量表現出最低的水平，0.88 mm次之，0.43、0.23、0.12 mm 的激素水平表現最高。除竹葉便E1G 和CORT 不符合這種規律外（不同粒徑間激素含量均不存在顯著差異），其余均符合。在一定程度上可以證實，孔徑越小的篩網篩選的糞便顆粒中含有的激素越多。這種現象可能是越小的糞便顆粒其表面積越大，會吸附更多的類固醇激素；糞便類固醇激素主要來源于腸組織，糞便表層會直接接觸腸黏膜而積累更多的激素［14］，這類黏膜物質被凍干后會變成較小的顆粒物。另外，激素含量是指單位干重糞便中的激素質量，在同等取樣量下，糞便顆粒越小且占比越大時，其激素含量也會越高。有研究表明，動物所食食物纖維含量與糞便激素含量存在著關聯性［18］，對于食物纖維含量較高的動物糞便采用凍干研篩的處理方式得到的激素含量要比凍干研磨的高，而這種差異性歸因于高纖維食物的影響［19］。因此，篩網孔徑的選擇應考慮到動物的食物結構即高纖維含量和消化特點，如李靜宇［19］會利用0.03 mm 孔徑的篩網處理短尾猴（Macaca thibetana）糞便以檢測雌二醇與孕酮含量。對大熊貓而言，其糞便中含有較高的竹纖維，竹纖維幾乎占據整團糞便且尺寸較大。大孔徑的篩網會篩選出更多的竹纖維，而小孔徑的篩網會增加篩取難度和減少糞樣獲取量以至于分析樣品量不足。研究結果表明0.43、0.23、0.12 mm 孔徑間均不存在顯著差異，但從實操性考慮，0.43 mm（35 目）孔徑篩網是較為合適的選擇。

除此以外，本研究還發現類固醇激素含量與樣品在取樣試管中的位置存在一定的相關性。取樣試管上、中、下各組間在E1G、P4 和CORT 上均表現出極顯著差異水平，雖然各激素差異性表現有所不同，但仍可以發現，上部與下部間的激素含量在3 個指標下均存在顯著差異（圖2），下部的激素含量最高。究其原因，可能是為了取滿糞樣，操作時會提供向下的作用力，同時受到“巴西堅果效應”（Brazil-nut effect）［20］的影響，使得體積較大的糞便顆粒上升到表層，而較小的糞便顆粒沉降到底部。從上往下的取樣方式使越靠近底部的小顆粒糞便含量增加，激素含量也隨之增高。因此為了減輕這種影響，前人研究中均提到樣品均質化的必要性［2，14］，本研究進一步進行了相關驗證。因此，筆者建議取樣時不宜將取樣管裝得過滿，約占取樣管一半為宜，留足空間便于采用上下顛倒的方式進行混樣。

綜上，篩網孔徑的正確選擇和糞樣的充分混合是必要和重要的，會大大提高激素測定的準確性。本研究不僅提供了一種適用于大熊貓糞便類固醇監測的真空冷凍干燥研篩法（簡稱為凍干研篩法），還提供了一種可作參考的混樣方法，以期為大熊貓糞便類固醇激素研究提供方法借鑒，為今后糞便激素監測方法的標準化建立提供一定的基礎性參考。

致謝：本研究得到了中國大熊貓保護研究中心嚴嘯博士在數據處理與分析上的幫助，以及神樹坪基地張貴權主任和李果、程建斌等同事在樣品采集上的大力支持與協助，在此一并表示由衷的感謝。